集菌法制造技术

本发明专利技术提供一种操作简便且可高效地对微生物进行集菌的手段。即，一种标本中的选自由革兰氏阳性菌(其中，不包括支原体)、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法，其特征在于，向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质，回收所得到的聚集体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】集菌法
本专利技术涉及微生物的集菌法。
技术介绍
微生物污染是用于饮食品、药品、再生医疗等的试剂的重要管理指标之一。因此，已知有使用高压釜或过滤器进行灭菌从而避免微生物污染的方法。然而，在灭菌困难的情况下需要对它们进行无菌处理，最终检查无微生物污染。此外，即使实施了灭菌处理，也需要确认灭菌处理的效果足够充分。另一方面，即使混入了微量的极小的微生物，也很难准确地检测到。此外，当有大量标本时，对所有标本进行检测也不现实。因此，需要一种可有效地对微生物进行集菌或分离的方法。例如，作为简便且高效地采集细胞的方法，已知将与细胞表面的糖结合的被称为MDP1的蛋白质用作聚集促进剂，其无需离心分离即可使细胞沉淀。并且，还报道了添加固定有抗体的颗粒等固体支撑物的方法(例如，参考专利文献1)。此外，已知有添加微生物提取蛋白、且将细胞悬液的pH值调节为1至5从而使细菌聚集，从细菌悬液中分离出细菌细胞的方法(例如，参考专利文献2)。然而，在专利文献1的方法中，MDP1是牛分歧杆菌(MycobacteriumBovis，BCG)的蛋白质，存在提纯MDP1的过程繁杂的问题。此外，在专利文献2的方法中，微生物提取蛋白中不仅会混入各种蛋白质(包括DNAse、RNAse等酶)，还会混入DNA、RNA等掺杂物，有可能对集菌后的微生物检测造成影响，且在需要进一步调节细胞悬液的pH值的点上也较繁杂。因此，寻求一种无需繁杂操作即可高效地对微生物进行集菌的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2010-104250号公报专利文献2：日本特开昭50-135275号公报
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题因此，本专利技术的技术问题在于提供一种操作简便且可高效地对微生物进行集菌的手段。解决技术问题的技术手段鉴于该状况，本申请的专利技术人为了解决所述技术问题反复进行了认真研究，结果发现通过向标本中添加选自特定的5种容易获得且结构等明确的蛋白质、优选进一步添加水不溶性载体，选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物高效地形成聚集体从而能够进行集菌，进而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及以下的[1]～[10]。[1]一种标本中的选自由革兰氏阳性菌(其中，不包括支原体)、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法，其特征在于，向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质，回收所得到的聚集体。[2]根据所述[1]所述的方法，其为革兰氏阳性菌(其中，不包括支原体)和/或革兰氏阴性菌的集菌法。[3]根据所述[1]或[2]所述的方法，其中，向标本中添加所述蛋白质后的pH值大于5.0且为11.0以下。[4]根据所述[1]～[3]所述的方法，其中，标本为选自由无菌水、生理盐水、液体培养基、生物试剂、培养上清液、缓冲液及林格氏液组成的组中的液体标本。[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的方法，其为革兰氏阳性菌的集菌法。[6]根据所述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，革兰氏阳性菌为选自由葡萄球菌属、肠球菌属、链球菌属、梭菌属、棒状杆菌属及芽孢杆菌属组成的组中的一种以上。[7]根据所述[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，革兰氏阳性菌为选自由金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及生孢梭菌组成的组中的一种以上。[8]根据所述[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，进一步向标本中添加水不溶性载体。[9]一种选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的测定方法，其特征在于，使通过所述[1]～[8]中任一项所述的方法进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行聚合酶链式反应。[10]一种选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的测定方法，其特征在于，对通过所述[1]～[8]中任一项所述的方法进行了集菌的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行增菌。专利技术效果由于本专利技术的方法添加选自特定的5种容易获得且已知蛋白质中的蛋白质，因此与不添加时相比，可极高效地对选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行集菌。此外，通过使用本专利技术的方法，能够从标本中，对作为日本药局方(第十七次修订)4.06中规定的无菌试验法中需确认(validation)的供试菌株的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物有效地进行集菌。此外，本专利技术的方法不需要根据检测日调整微生物，制备微生物蛋白或微生物提取蛋白，并且，不需要确认用于制备这些微生物所需的溶剂及试剂中未混入选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物，因此非常方便。进一步，由于本专利技术的方法任意使用乳胶颗粒等水不溶性载体，因此即使是少量的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物，分离后的聚集体也不易扩散并同时易于用肉眼确认，从而容易去除通过集菌使菌沉淀后的上清液。并且，由于本专利技术的方法损伤细菌的可能性小，因此能够对集菌后的细菌进行培养等，由此也能够使用培养后的菌落供试于其他试验。并且，本专利技术的方法不会混入来自细胞的DNA、RNA、DNA水解酶、RNA水解酶及其他蛋白质，因此集菌后的核酸扩增反应操作变得容易。具体实施方式以下，以优选的实施方案为中心对本专利技术进行具体说明。另外，本专利技术并不受这些实施方案的任何限定。在本专利技术中，“选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌”，是指分离并浓缩标本中所含有的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物。通过对选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物进行集菌，能够容易地进行后续实施的无菌试验。本专利技术的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法是对通过向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质而形成的聚集体进行回收的方法。在本专利技术中，革兰氏阳性菌是指会被革兰氏染色且被染成靛蓝色或深紫色的细菌。革兰氏阳性菌通常是细胞壁厚、无外膜的菌，具有肽聚糖层厚的特征。革兰氏阳性菌根据形状可分为革兰氏阳性球菌及革兰氏阳性杆菌。另外，虽然出于方便而将支原体分类为革兰氏阳性菌，但其不具有细胞壁而不能进行革兰氏染色，因此并不包括在本专利技术中的革兰氏阳性菌中。革兰氏阳性球菌包括葡萄球菌属[例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等]、肠球菌属[例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)等]、链球菌属[例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)等]等，但并不限定于此。革兰氏阳性杆菌包括梭菌属[例如生孢梭菌(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种标本中的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法，其特征在于，向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质，回收所得到的聚集体，所述革兰氏阳性菌不包括支原体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20181025 JP 2018-2004761.一种标本中的选自由革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌组成的组中的一种以上的微生物的集菌法，其特征在于，向标本中添加选自由白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、乳蛋白及明胶组成的组中的一种以上的蛋白质，回收所得到的聚集体，所述革兰氏阳性菌不包括支原体。


2.根据权利要求1所述的集菌法，其为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌的集菌法，所述革兰氏阳性菌不包括支原体。


3.根据权利要求1或2所述的集菌法，其中，向标本中添加所述蛋白质后的pH值大于5.0且为11.0以下。


4.根据权利要求1～3所述的集菌法，其中，标本为选自由无菌水、生理盐水、液体培养基、生物试剂、培养上清液、缓冲液及林格氏液组成的组中的液体标本。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的集菌法，其为革兰氏阳性菌的集菌法。


6.根据权利要求1～5...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳田梨纱，
申请(专利权)人：日水制药株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP