使用人永生化髓样细胞体外评价物质的安全性的方法技术

一种体外评价物质安全性的方法，发现了一种通过使用人永生化髓样细胞而更具稳定性、重现性、经济性及操作容易性的方法。一种使用人永生化髓样细胞评价待测物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法、检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法、以及评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用的方法，本发明专利技术的方法包括测定人永生化髓样细胞的培养液中的IL

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用人永生化髓样细胞体外评价物质的安全性的方法
相关申请的交叉引用本国际申请要求基于2019年11月19日向日本专利局申请的日本专利申请第2019
‑
208711号的优先权，日本专利申请第2019
‑
208711号的全部内容通过参考引用在本国际申请中。


本专利技术涉及一种使用人永生化髓样细胞体外评价物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法、检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法、以及评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用的方法。

技术介绍

当提供供人类等饮食或涂抹的产品及物质时，需要预先确认该产品中所含的物质是否安全，是否会引起过敏反应等。在其测试方法中，例如，作为是否为会诱发过敏等的物质的评价方法，采用了如下方法：例如将该物质对小鼠或豚鼠等实验动物给药或涂布等，观察该实验动物的皮肤上的炎症反应等。另外，作为用于确认食品及化妆品等是否被病毒或菌类等污染的测试，存在利用兔子进行的发热性测试。然而，从保护动物等观点出发，减轻所使用动物的痛苦、及减少所使用动物的数量成为大势所趋，要求向替代方法转变。迄今为止，作为皮肤致敏性的评价方法，已经建立了利用实验动物进行的豚鼠最大值试验Guinea Pig Maximization Test(GPMT)、佐剂和斑贴试验Adjuvant and Patch Test(A&P)、Buehler Test(BT)、局部淋巴结试验Local Lymph Node Assay(LLNA)等。例如，在GPMT、A&P、BT测试中，将豚鼠用作实验动物，通过数次皮下给药或者封闭贴敷溶解有物质的测试液，使豚鼠致敏，然后再次封闭贴敷测试液，除去该测试液后，观察皮肤反应，对红斑及浮肿进行评分，以评价是否存在皮肤致敏性。另外，在LLNA测试中，将小鼠用作实验动物，向小鼠的耳廓数次涂布测试液后，静脉给药放射性标记物质(例如，3H
‑
胸腺嘧啶)，测定耳廓的淋巴结中标记物质的摄取量，将淋巴细胞增殖是否激活作为指标来评价有无皮肤致敏性。另外，如上所述，作为发热性测试的评价方法，已经建立了使用兔子进行的测试。预先使用温度传感器测定直肠温度之后，向兔子的耳廓静脉等投予测试液，测定数小时后的体温升高情况，并以升高程度为标准进行判断，以评价是否包含发热性物质。近年来，以欧州为主，推崇动物保护3R(从实验动物向其它评价方法转变(Replacement)、减少所使用的数量(Reduction)、减轻动物的痛苦(Refinement))，并且，自2009年起，欧州全面禁止化妆品及其原料的动物实验，并制定法律禁止销售曾实施动物实验的产品。因此，近年来，正在开发及报道替代动物实验的评价方法。例如，皮肤致敏性是指因致敏物质接触或渗透至皮肤而产生的反应。其机理如下：1)物质接触皮肤；2)物质被经皮吸收；3)与蛋白质结合并被树突状细胞吞噬；4)吞噬后的树
突状细胞激活，迁移至所属淋巴结；5)在所属淋巴结中，T细胞接受树突状细胞的抗原提呈，从而激活并增殖。若产生了这些过程，则会产生免疫诱导，若再次接触相同的物质，则会从增殖后的T细胞中释放炎症细胞因子，从而引发过敏性炎症反应(红斑及浮肿)。基于该机理，开发了体外评价中的替代测试。例如，直接肽反应性测定(Direct Peptide Reactivity Assay，DPRA)是指使用液相色谱测定蛋白质与物质是否容易结合的方法。另外，人细胞系活化试验(h
‑
CLAT)是指，在树突状细胞激活的过程中，使用THP
‑
1细胞，通过流式细胞仪来测定是否表达激活标志物的方法。这些是不使用动物的方法。h
‑
CLAT是2016年收录在经济合作与发展组织(OECD)的指南中的皮肤致敏性测试替代方法。株式会社资生堂等发现，在皮肤上，作为抗原提呈细胞的朗格汉斯细胞的CD86或CD54、MHC ClassII的细胞表面蛋白量因皮肤致敏性物质而增加，并开发了利用该现象的替代方法。但是，朗格汉斯细胞仅存在于表皮中，而且，显示出朗格汉斯细胞样的树突状细胞也难以稳定供应，因此，建立了利用人单核细胞(THP
‑
1)的替代方法h
‑
CLAT。与例如LLNA评价相比，作为实验动物替代方法的h
‑
CLAT在评价时不使用动物(小鼠)、测试时间较短等，因此实用性较高。然而，其作为体外评价方法，与所构筑的其它方法例如DPRA相比，操作繁琐，限制较多。例如，必须预先准备THP
‑
1细胞，及预先通过预测试掌握添加浓度，并且，表面标志物测定时使用流式细胞仪。并且，还存在如下课题：必须对阳性对照及介质对照持续测定；及重现性(约80％)不高(非专利文献1)。另外，还存在如下课题：THP
‑
1细胞中的氧化还原酶细胞色素P450不足，细胞色素P450通过由单核细胞分化而不断激活，在物质通过氧化、还原而显示皮肤致敏性时，则不能检测出来(非专利文献2)。因此，需要一种与h
‑
CLAT相比能够更简便稳定地体外评价物质的皮肤致敏性的方法。另外，在发热性测试中，开发了实验动物替代方法。开发了如下方法：可以使用非哺乳动物马蹄蟹的血液来判定是否被革兰氏阴性菌污染；及利用来自人急性单核细胞白血病的Mono
‑
Mac
‑
6细胞及人外周血，通过可能被菌类等污染的标本进行刺激，从而产生IL
‑
6等细胞因子，进而利用这样现象进行测定。然而，用马蹄蟹的血液仅能够检测革兰氏阴性菌。另外，用Mono
‑
Mac
‑
6的方法的灵敏度比人血低。并且，人外周血虽然能够在体外评价人的状态，但由于利用通过献血等得到的血液，因此难以稳定供应，同时还会产生个体差异。因此，需要一种用于检测皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法，其利用与人的树突状细胞类似的组织及细胞，能够稳定且大量供应。另外，免疫细胞通过所释放的细胞因子而发挥功能，目前，尚不存在可以测试药剂及食品等对免疫细胞的直接作用的系统。例如，为了评价食品素材对免疫细胞的功能所产生的作用，具有利用人外周血进行的方法，但由于利用通过献血等得到的血液，因此难以稳定供应，有时还会产生个体差异。因此，需要一种能够简便稳定地供应且能够评价体外功能性的方法。现有技术文献非专利文献
非专利文献1：皮肤致敏性测试评价报告书JaCVAM皮肤致敏性测试资料编撰委员会非专利文献2：Takao Ashikaga等，ATLA 38，275
‑
284，2010

技术实现思路

专利技术要解决的问题即，本专利技术的课题在于，发现一种体外评价物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法、检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法、以及样品对免疫细胞的功能所产生的作用的评价方法，这些方法更具有稳定性、重现性、经济性、及操作容易性。解决问题的方法本专利技术的专利技术人为了摸索到一种提供适合在体外评价皮肤致敏性和/或发热性、检测皮肤致敏性物质和/或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种评价待测物质的皮肤致敏性和/或发热性的方法，包括：测定在所述待测物质存在下培养人永生化髓样细胞而得到的培养液中的IL
‑
6和/或IL
‑
8的产量的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，培养所述人永生化髓样细胞时，所述待测物质的浓度包括大于0μg/mL且1000μg/mL以下之间的至少三种浓度。4.根据权利要求1～权利要求3中任一项所述的方法，其中，所述培养时间选自3小时～48小时之间的至少一种。5.根据权利要求1～权利要求4中任一项所述的方法，其中，所述产量通过免疫测定法测定。6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述免疫测定法为ELISA。7.根据权利要求1～权利要求6中任一项所述的方法，其中，还包括：当所述产量相对于阴性对照的产量为1.5倍以上时，判定所述待测物质具有皮肤致敏性和/或发热性的步骤。8.一种检测样品中的皮肤致敏性物质和/或发热性物质的方法，包括：测定在样品存在下培养人永生化髓样细胞而得到的培养液中的IL
‑
6和/或IL
‑
8的产量的步骤。9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。10.根据权利要求8或权利要求9所述的方法，其中，培养所述人永生化髓样细胞时，所述样品的浓度包括至少三种浓度。11.根据权利要求8～权利要求10中任一项所述的方法，其中，所述培养时间选自3小时～48小时之间的至少一种。12.根据权利要求8～权利要求11中任一项所述的方法，其中，所述产量通过免疫测定法测定。13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述免疫测定法为ELISA。14.根据权利要求8～权利要求13中任一项所述的方法，其中，还包括：当所述产量相对于阴性对照的产量增加时，判定所述样品中包含所述皮肤致敏性物质和/或发热性物质的步骤。15.根据权利要求8～权利要求14中任一项所述的方法，其中，所述皮肤致敏性物质和/或发热性物质为脂多糖(LPS)和/或金黄色葡萄球菌Cow an 1(SAC)。16.一种评价样品对免疫细胞的功能所产生的作用的方法，包括：测定在样品存在下培养人永生化髓样细胞而得到的培养液中的细胞因子的产量的步骤。17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述人永生化髓样细胞是人永生化单核细胞或由该人永生化单核细胞制备的树突状细胞。18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中，所述细胞因子选自IL
‑
1a、IL
‑
1b、IL
‑
1ra、IL
‑
2、IL
‑
2Ra、IL
‑
3、IL
‑
4、IL
‑
5、IL

【专利技术属性】
技术研发人员：宫崎和雄，清水淳，田中善孝，
申请(专利权)人：日水制药株式会社，
类型：发明
国别省市：