本发明专利技术提供了一种调控机体适应性细胞与体液免疫的纳米载体的构建与应用。本发明专利技术所述的纳米载体是通过将具有内质网趋向性的小分子或多肽修饰于负载抗原的纳米粒子表面，改变外源性抗原在树突状细胞中的摄取总量、转运路径及加工呈递方式，从而调控机体抗原特异性的细胞免疫与体液免疫。本发明专利技术所述的纳米载体可以是阳离子的纳米乳、脂质体或脂质纳米粒等载药系统，抗原可涉及肿瘤、病毒或疟原虫特异性的抗原蛋白/多肽。该纳米载药系统通过提高机体适应性免疫，尤其是细胞免疫的参与度，来调动抗肿瘤、抗病毒或抗寄生虫感染的特异性免疫响应，具有方案新颖、制备简单、应用范围广的特点。
【技术实现步骤摘要】
调控适应性细胞与体液免疫的纳米载体的构建与应用
本专利技术属于制药领域，涉及一类可增敏蛋白/多肽亚单位疫苗功效、调控机体适应性细胞与体液免疫的纳米载药系统，尤其涉及能调控适应性细胞与体液免疫的纳米载体的构建，以及该纳米载体在制备抗肿瘤、抗病毒和抗寄生虫感染药物中的应用。
技术介绍
人类社会的发展多次受到肿瘤、病毒和感染的严重打击，而疫苗的出现是人工主动应对病原物质侵袭的重要转折点，具有可控性高、易于普及、能反复接种增强特异性免疫记忆从而提供长期保护等优势。出于安全性和生产成本等考虑，基于蛋白/多肽的亚单位疫苗成为了传统免疫技术的代表，也是当下主流的疫苗类型之一。通过筛选病原物特异性的抗原表位，纯化或构建包含该表位信息的蛋白/多肽，随后选择合适的递送载体和给药方式，向潜在的易感染人群(预防性疫苗)或已受病原物侵袭的个体(治疗性疫苗)进行单次或间隔式多次疫苗免疫，从而活化体内的抗原呈递细胞(APCs)，启动特异性T/B淋巴细胞响应，诱导细胞和体液免疫的协同调动，放大对病原物的识别、杀伤与记忆。树突状细胞(DCs)作为机体功能最强的APCs，具有诱导机体适应性细胞免疫和体液免疫的双潜能。抗原在DCs内经历剪切加工后与主要组织相容性复合物分子(MHC)组装，形成抗原肽-MHCI类或II类分子复合物(p-MHCI或p-MHCII)。其中，内源性抗原(位于胞浆，包括被病毒感染的细胞内合成的病毒蛋白、某些细胞内的自身抗原等)通常进入MHCI类呈递途径，形成的p-MHCI与CD8+T细胞表面受体(TCR)特异性识别，从而诱导CD8+T细胞的活化，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的效应分化及靶细胞杀伤，启动细胞免疫；外源性抗原(吞噬获得，包括被吞噬的细胞、细菌或蛋白质抗原等)通常形成p-MHCII，后者与CD4+T细胞的TCR结合，诱导辅助性CD4+T细胞(Th)的分化，促进B细胞的活化、浆细胞样分化和特异性中和抗体的产生，引发体液免疫。细胞与体液免疫在生物体内相辅相成，两者的配合发挥决定了免疫响应的有效性和持久性。目前，蛋白/多肽类抗原的应用主要受到以下限制：1)免疫原性低，通常需要佐剂辅助；2)分子量大且多呈弱负电性，受APCs摄取少；3)作为外源性的“异己”成分，被APCs内化后大多进入MHCII类路径呈递以诱导体液免疫，对MHCI依赖、CD8+T细胞主导的细胞免疫的调动不足。细胞免疫的缺乏严重影响了机体抗病毒、抗肿瘤和抗感染免疫的发挥。如，CD8+T细胞的耗竭弱化了光动力-光热疗法引发的抗肿瘤效果[Nat.Commun.,2019,10:3349]、限制了重组腺病毒载体疫苗对埃博拉病毒感染的保护作用[Nat.Med.,2011,17:1128-1131]、促进了白介素15超激动剂N-803诱导的潜伏期HIV或HSV病毒的再激活与复制[Nature,2020,578:154-159]。通过提高机体细胞免疫响应来实现细胞与体液免疫的协同调动，可增强机体对病原物侵袭的抵抗力。如，Thakur等人[JImmunother.,2011,34(5):457-467]通过联合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导系统性细胞和体液免疫应答，增强了经皮冷冻疗法的抗肿瘤效果；Cao等人[Nat.Commun.,2018,9:3695]在蛋白抗原的皮下疫苗中引入无创射频来诱导局部炎症，促进皮肤和引流淋巴结处DCs的成熟，提高抗原特异性体液和细胞响应，在抗流感病毒侵袭中具有一定应用潜能；Wilson等人[Nat.Mater.,2019,18:175-185]合成了具有DCs靶向性和活化诱导性的糖佐剂p(Man-TLR7)，将其与恶性疟原虫相关的抗原蛋白偶联，增加了抗原在DCs的胞浆释放，促进DCs对T细胞的抗原呈递，实现了抗疟疾细胞与体液免疫的联动。调控MHC分子的参与类型和参与程度是决定抗原诱导的优势淋巴细胞亚群及免疫响应(细胞免疫或体液免疫)的关键。目前，增强机体对蛋白/多肽类抗原的特异性细胞免疫应答主要是通过提高DCs对这类外源性抗原的MHCI类呈递来实现的，包括以下手段：1)促进抗原在DCs的胞浆释放，如，利用pH响应性材料、细胞穿膜肽或膜融合肽修饰抗原递送载体(或直接修饰抗原)，促进外源性抗原在DCs的胞浆扩散以获得内源性特征，从而进入MHCI类呈递途径[ExpertOpinDrugDel.,2015.13(3):373]；2)延长抗原在DCs的胞内稳定性，主要是通过调控DCs的内体酸度或溶酶体酸度，限制抗原的过度降解，维持MHCI类呈递所需的重要抗原表位的完整性并减少溶酶体介导的MHCII类抗原呈递[PNAS,2009,106(16):6730-6735]；3)添加刺激因子来诱导DCs的成熟与分化，如引入佐剂或某些细胞因子来改善DCs的数量与质量，以此提高适应性免疫响应的整体效力[ACSAppl.Mater.Interfaces.,2018,10(39):33532-33544]；4)对抗原引入适宜的靶向特性，从而提高抗原的利用率和p-MHCI的呈递潜能，主要包括抗原的淋巴结靶向[Biomaterials,2016,98:171-183]、DCs靶向(尤其是MHCI类呈递能力更优的DC亚群，如cDC1)[Blood,2010,116(19):3828-3838]和DCs的内质网(ER)靶向[J.Immunol.,2013,191(12):6010-6021]。在DCs中，ER是MHC分子合成、抗原肽进一步加工及p-MHCI组装的关键场所，将外源性抗原靶至DCs的ER可利用内质网相关降解机制来促进抗原的剪切加工、p-MHCI的组装与表达，从而提高抗原特异性细胞免疫应答。目前，将外源性抗原递送至DCs的内质网在提高蛋白/多肽类亚单位疫苗的免疫效应中的作用逐渐得到认可，相关的细胞分子机制也不断被揭示。然而，由于缺乏有效的靶向手段和合适的抗原递送载体，这种策略在抗肿瘤、抗病毒和抗感染中的应用十分有限。具体来说，抗原的结构对诱导特异性免疫响应至关重要，内质网趋向性分子对抗原的直接修饰容易破坏抗原的天然结构，影响免疫应答的有效性和特异性；同时，这种直接的偶联对抗原的胞内解离和释放提出较高的要求；此外，针对不同抗原，靶向修饰的方式和程度不同，制备成本高、难度大，不利于放大生产。相比之下，纳米载体具有表面修饰多样性，药物装载兼容性和药物释放可控性等优势，更适合蛋白/多肽类抗原的靶向递送。基于以上介绍，本专利技术专利构建了一类内质网靶向性抗原递送载体，由生物安全性高、免疫原性弱、容易获得且生产成本低的脂质作为主要的载体材料，用内质网趋向性的小分子或多肽修饰脂质材料并暴露于载体表面，利用载体的阳离子性质和亲水亲脂性实现肿瘤、病毒或疟原虫特异性抗原蛋白/多肽的内部包裹和/或表面吸附。这类载体具有优良的抗原装载和内质网靶向能力，其制备方便、成本低廉、性质稳定，可以提高抗原的细胞摄取，改变抗原的胞内转运和呈递命运，从而调控细胞和体液免疫应答，具有良好的生产和应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种能调控适应性细胞与体液免本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.调控适应性细胞与体液免疫的纳米载体的构建，其特征在于，通过以下方案实现：/n(1)纳米载体的构建与带电性质：/n以磷脂酰胆碱、维生素E、内质网靶向修饰脂质和阳离子脂质作为油相，抗原蛋白/多肽的水溶液作为水相，制备水包油型阳离子纳米乳，阳离子脂质占载体结构脂质总质量的1％-60％；/n(2)纳米载体的内质网靶向性表面修饰：/n在步骤(1)阳离子纳米乳中掺入具有内质网靶向作用的小分子或与脂质化学键合的多肽，得到具有内质网趋向性或定位能力的小分子或多肽修饰的纳米载体，其中，具有内质网靶向作用的化合物占总脂质质量的1％-30％。/n
【技术特征摘要】
1.调控适应性细胞与体液免疫的纳米载体的构建，其特征在于，通过以下方案实现：
(1)纳米载体的构建与带电性质：
以磷脂酰胆碱、维生素E、内质网靶向修饰脂质和阳离子脂质作为油相，抗原蛋白/多肽的水溶液作为水相，制备水包油型阳离子纳米乳，阳离子脂质占载体结构脂质总质量的1％-60％；
(2)纳米载体的内质网靶向性表面修饰：
在步骤(1)阳离子纳米乳中掺入具有内质网靶向作用的小分子或与脂质化学键合的多肽，得到具有内质网趋向性或定位能力的小分子或多肽修饰的纳米载体，其中，具有内质网靶向作用的化合物占总脂质质量的1％-30％。
2.根据权利要求1所述的构建，其特征在于，步骤(1)所述油相中的维生素E，能用大豆油、橄榄油、中链脂肪酸酯、硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、角鲨烯替代。
3.根据权利要求1所述的构建，其特征在于，步骤(1)所述油相中的阳离子脂质为带正电荷的脂质或可电离脂质，所述带正电荷的脂质可选用(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵、二甲基双十八烷基铵、1,2-二甲基-3-三甲基铵-丙烷、1,2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)或3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；所述可电离脂质，选用4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯。
【专利技术属性】
技术研发人员：游剑，施莹莹，李青坡，姜新东，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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