一种抗肿瘤疫苗分子及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及抗肿瘤疫苗领域，公开了一种抗肿瘤疫苗分子及其制备方法和应用。本发明专利技术中的抗肿瘤疫苗分子具有式(I)所示结构，在所述式(I)中，A为佐剂，B为抗原，且m个所述A分别通过共价连接臂与所述蛋白共价连接，以及n个所述B分别通过共价连接臂与所述蛋白共价连接。本发明专利技术中的抗肿瘤疫苗是新的抗肿瘤分子，免疫性能好，能够产生较高滴度的IgG抗体和较强的细胞免疫能力，热稳定性好，易于保存和运输。A

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤疫苗分子及其制备方法和应用
本专利技术涉及抗肿瘤疫苗领域，具体涉及一种抗肿瘤疫苗分子及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞生物学和生物化学的广泛研究表明，肿瘤相关抗原(TACAs，例如MUC1糖蛋白)是免疫治疗的理想靶点，在免疫治疗抗癌策略的发展中被大力追求。迄今为止，免疫疗法已被证明是最有前途的癌症治疗方法之一，提供了许多可能性。然而，由于常用的肿瘤相关抗原作为自身抗原，抗原性差，免疫调节耐受性差的原因，导致不能引起有效的免疫应答。因此，提高肿瘤相关抗原的免疫原性，成为急需解决的问题。大量的研究都努力去获得更好的免疫原性的肿瘤相关抗原，以及将抗原连接到不同免疫刺激组分的连接体：完全合成的含内置佐剂的两组分抗癌疫苗，含Th细胞表位和内置佐剂的三组分抗癌疫苗或具有Th、Tc细胞表位和内置佐剂的多组分抗癌疫苗，其中常用的佐剂包括Toll样受体2脂肽配体(Pam3CSK4)、单磷酰脂质A(MPLA)、CpG、NKT细胞激动剂(αGalCer)等。动物实验结果表明，随着疫苗组分数量的增加，小鼠对肿瘤相关抗原的免疫应答可能逐渐增强，但合成难度进一步加剧。进一步地，也有研究公开疫苗配备了优化的未共价连接的MUC1或尼古丁抗原和αGalCer，显著提高了抗原的免疫原性。另外，半合成抗癌疫苗通常为肿瘤相关抗原与不同的载体蛋白结合，然后与佐剂混合组成疫苗，其中载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、CRM197(白喉毒素无毒突变体)、破伤风类毒素(TTOX)和钥孔血蓝蛋白(KLH)。鉴于载体蛋白具有多个Tc和Th表位，可以增强抗原的提呈，进而能够容易地提高疫苗的免疫反应。然而，为了开发更有效的抗肿瘤免疫治疗策略，目前的挑战仍然存在。并且，Toll样受体(TLR)是一种细胞内模式识别受体，能够识别多种病原体高度保守的成分，诱导宿主的先天和适应性免疫反应。其次，具有调节抗原呈递细胞活化的潜能，加强共刺激分子和许多细胞因子的分泌。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的肿瘤相关抗原免疫原性差的问题。为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供一种具有式(I)所示结构的抗肿瘤疫苗分子，在所述式(I)中，A为佐剂，B为抗原，且m个所述A分别通过共价连接臂与所述蛋白共价连接，以及n个所述B分别通过共价连接臂与所述蛋白共价连接，所述蛋白中的氨基酸分子数大于等于100；所述式(I)中的m为大于等于1的整数，n为大于等于1的整数；Am-蛋白-Bn式(I)。本专利技术的第二方面提供一种制备前述第一方面所述具有式(I)所示结构的抗肿瘤疫苗分子的方法，该方法包括：将抗原与蛋白进行第一偶联，并将得到的第一中间体与佐剂进行第二偶联；或者将佐剂与蛋白进行第三偶联，并将得到的第二中间体与抗原进行第四偶联。本专利技术的第三方面提供前述第一方面所述具有式(I)所示结构的抗肿瘤疫苗分子在抗肿瘤疫苗中的应用。用于疫苗的多肽和蛋白质在结构、制备和性质上有明显的区别：(1)多肽的组成氨基酸个数少(<100，一般使用的多肽<50个氨基酸)、分子量小；蛋白质组成氨基酸个数多(>100)、分子量大、体积大；(2)多肽一般通过化学合成，可修饰位点较少，容易在化学合成过程中或合成后修饰，可用HPLC提纯；蛋白质一般通过生物合成，可修饰位点多，主要在合成后水相中修饰，不能用HPLC提纯；(3)多肽体积小，易扩散，不易在淋巴组织富集，所含Th和Tc表位一般少于3个，免疫原性较弱；蛋白质体积大，不易扩散，容易在淋巴组织富集，所含Th和Tc表位多，免疫原性较强。本专利技术提供的内嵌佐剂蛋白偶联物策略的设计是设计高效免疫治疗抗癌疫苗的有效策略。与传统疫苗策略相比，本专利技术中的抗肿瘤疫苗是新的抗肿瘤分子，免疫性能好，能够产生较高滴度的IgG抗体和较强的细胞免疫能力，热稳定性好，易于保存和运输。附图说明图1为本专利技术的优选的具体实施方式抗肿瘤疫苗分子，其中，图1A表示根据本专利技术的优选的具体实施方式所述的抗肿瘤疫苗分子，在图1A中，免疫激动剂为佐剂，LK1和LK2均表示共价连接臂；图1B表示根据本专利技术的另一个更优选的具体实施方式所述的抗肿瘤疫苗分子，在图1B中，TLR激动剂为佐剂，LK1和LK2均表示共价连接臂。图2表示实施例9中所述的对于第一次免疫后2h取的血清，细胞因子IFN-γ和IL-6测试。图3表示实施例10中所述的三免针对MUC1的IgG抗体滴度测试结果。图4表示实施例10中所述的一免、二免、三免针对MUC1的IgG抗体滴度测试结果对比。图5表示实施例10中所述的一免、二免、三免针对MUC1的IgM抗体滴度测试结果对比。图6表示实施例10中所述的三免针对MUC1的IgG亚型抗体滴度测试结果对比。图7表示实施例11中所述的三免针对BSA的IgG抗体滴度测试结果对比。图8表示实施例12中所述的用MTT法测定MCF-7细胞的存活率。图9表示实施例13中所述的用流式细胞仪测定疫苗诱导抗血清与MCF-7细胞的结合情况。图10表示实施例15中所述的MCF-7细胞的裂解率。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。如前所述，本专利技术的第一方面提供了一种具有式(I)所示结构的抗肿瘤疫苗分子，在所述式(I)中，A为佐剂，B为抗原，且m个所述A分别通过至少一个共价连接臂与所述蛋白共价连接，以及n个所述B分别通过至少一个共价连接臂与所述蛋白共价连接所述蛋白中的氨基酸分子数大于等于100；所述式(I)中的m为大于等于1的整数，n为大于等于1的整数；Am-蛋白-Bn式(I)。根据第一种优选的具体实施方式，所述式(I)中的m为1，n为大于等于1的整数；例如m为1，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等。根据第二种优选的具体实施方式，所述式(I)中的m为1，n为大于等于2的整数；例如m为1，n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等。根据第三种优选的具体实施方式，所述式(I)中的m为大于等于2的整数，n为大于等于1的整数；例如m为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20等。根据第四种优选的具体实施方式，所述式(I)中的m为大于等于2的整数，n为大于等于2的整数；例如m为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有式(I)所示结构的抗肿瘤疫苗分子，其特征在于，在所述式(I)中，A为佐剂，B为抗原，且m个所述A分别通过至少一个共价连接臂与所述蛋白共价连接，以及n个所述B分别通过至少一个共价连接臂与所述蛋白共价连接，所述蛋白中的氨基酸分子数大于等于100；所述式(I)中的m为大于等于1的整数，n为大于等于1的整数；/nA

【技术特征摘要】
20191204 CN 20191122856731.一种具有式(I)所示结构的抗肿瘤疫苗分子，其特征在于，在所述式(I)中，A为佐剂，B为抗原，且m个所述A分别通过至少一个共价连接臂与所述蛋白共价连接，以及n个所述B分别通过至少一个共价连接臂与所述蛋白共价连接，所述蛋白中的氨基酸分子数大于等于100；所述式(I)中的m为大于等于1的整数，n为大于等于1的整数；
Am-蛋白-Bn式(I)；
优选地，所述式(I)中的m为1，n为大于等于2的整数；
优选地，所述式(I)中的m为大于等于2的整数，n为大于等于2的整数。


2.根据权利要求1所述的抗肿瘤疫苗分子，其中，所述抗原包括肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原、病原体抗原、生物毒素和生物分子抗原中的至少一种；
优选地，所述肿瘤相关抗原选自肿瘤相关多肽抗原、肿瘤相关糖肽抗原和肿瘤相关糖抗原中的至少一种。


3.根据权利要求2所述的抗肿瘤疫苗分子，其中，所述肿瘤相关多肽抗原或所述肿瘤相关糖肽抗原中含有选自MUC1、MUC16、NY-ESO-1、MAGE-A1/3/4、WT1、STAT3、HER2和GP100中的至少一种。


4.根据权利要求2所述的抗肿瘤疫苗分子，其中，所述抗原中含有MUC1，优选地，所述MUC1抗原选自以下结构中的至少一种：






其中，在含有MUC1的所述抗原的结构中，各个R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自氢和以下所示的糖结构：





5.根据权利要求2所述的抗肿瘤疫苗分子，其中，所述肿瘤相关糖抗原选自以下结构中的至少一种：





6.根据权利要求1-5中任意一项所述的抗肿瘤疫苗分子，其中，所述蛋白选自牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、流感嗜血杆菌D蛋白、B群脑膜炎球菌外膜蛋白复合体、百日咳类毒素、伤寒杆菌鞭毛、肺炎球菌溶血素和无毒性的白喉毒素突变体中的至少一种。


7.根据权利要求1-6中任意一项所述的抗肿瘤疫苗分子，其中，所述佐剂为模式识别受体激动剂；
优选地，所述模式识别受体激动剂选自Toll样受体激动剂和NKT激动剂中的至少一种；
优选地，所述Toll样受体激动剂选自TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂、TLR3激动剂、TLR2激动...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭军，杨光富，杜晶晶，王昌伟，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42