本发明专利技术涉及醇脱氢酶突变体及其在环状萜烯酮合成中的应用。具体涉及一种催化性能明显提高的醇脱氢酶突变体、其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该醇脱氢酶突变体或重组表达转化体催化羟基化合物脱氢反应，特别是催化羟基位于3‑和6‑位的环状萜烯醇的脱氢反应，以制备环状萜烯酮的应用。与野生型醇脱氢酶相比，本发明专利技术所述醇脱氢酶突变体对系列羟基化合物的脱氢反应活性均有一定幅度的提高，所述醇脱氢酶的突变体具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
醇脱氢酶突变体及其在环状萜烯酮合成中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种催化性能明显提高的醇脱氢酶突变体、其编码核酸，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该醇脱氢酶突变体或重组表达转化体催化羟基化合物脱氢反应，特别是催化羟基位于3-和6-位的环状萜烯醇的脱氢反应，以制备环状萜烯酮的应用。
技术介绍
L-(-)-薄荷醇也叫左旋薄荷脑，常温下为液体，水溶性较差，具有清凉的风味和一定香气，常被用在酒类、调味品、口腔保健品、化妆品等产品加工中(Phytochemistry,2013,96:15-25)。在自然界中，(-)-薄荷醇存在于薄荷植物叶片的油腺分泌细胞中，可通过萃取、常压蒸馏等手段得到(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,1999,97:2934-2939)。近几年来薄荷醇消耗量逐年大幅度上升，至2018年(-)-薄荷醇年消耗量达到约4万吨(Anhui.Chem.Ind.,2018)，其中约70％的(-)-薄荷醇是从植物薄荷蒸馏所得，受天气、土地和人力等因素影响极大。约有30％的(-)-薄荷醇是通过化学合成。目前为止，我国(-)-薄荷醇的市场很大，但国内薄荷醇的大面积种植产地较少，因此食品等行业内使用的天然(-)-薄荷醇大部分从印度和巴西进口。迄今为止国内尚无产量高、技术好的薄荷醇化学法合成企业。现在的(-)-薄荷醇的化学合成企业以日本Takasago和德国的Symrise两家独大。日本Takasago企业通过不对称合成的方法大规模合成(-)-薄荷醇(Chem.Biodivers,2014,11:1688-1699)；而德国Symrise企业则通过对映体拆分来制备(-)-薄荷醇(US20100249467A1,2010)。但这两者皆有缺陷，前者催化剂昂贵且污染严重，后者拆分困难，损失较多。除去日本Takasago和德国Symrise两家企业，剩下都是规模较小的化学合成法(CN107056587B,2017)。由于植物萃取法和化学合成法所得的(-)-薄荷醇仍无法满足市场需求，所以(-)-薄荷醇的生物合成法便引起了越来越多学者的注意。但目前生物法合成(-)-薄荷醇仍处于初级阶段，其中大部分都是通过动力学拆分外消旋的薄荷醇等衍生物来制备(-)-薄荷醇(TetrahedronAsymmetry.,2003,14:3313-3319)。目前效果较为显著的是通过在双水相体系中固定枯草芽孢的酯酶对乙酸薄荷酯进行拆分，其底物上载量可提高至3M，同时保证了>40％转化率和97％e.e.值，使得L-薄荷醇的大量生产成为可能(Adv.Synth.Catal.,2010,351:405-414)。但这类方法并不是从甘油、(-)-柠檬烯等便宜的化合物合成，且与(-)-薄荷醇的植物提取法面临相同的难题(ResearchonChemicalIntermediates,2018,44:6847-6860)。因此在微生物中模拟植物中的(-)-薄荷醇的从头合成途径更有可能实现(-)-薄荷醇的高效生物合成(JournalofBiologicalChemistry,1992,267:7582-7587)。目前在微生物中从头构建(-)-薄荷醇的途径虽尚未实现，但已取得优异的进展。NigelS.Scrutton所在课题组将薄荷醇途径中的后两步偶联起来，将烯还原酶(NtDBR)和(-)-薄荷酮还原酶(MMR)同时构建到大肠杆菌中，成功的从(+)-胡薄荷酮通过一锅煮的酶法合成了(-)-薄荷醇，打通(-)-薄荷醇生物合成途径的后两步(ACSSynth.Biol.,2015,4:1112-1123)，这让体外构建薄荷醇的途径有了希望。随后在2018年，该课题组通过细菌来源的异构酶(KSI)替代了异胡薄荷酮异构酶(IPGI)又实现了从(+)-顺式-异胡薄荷酮合成(-)-薄荷醇(25.5mg/L)。再加上2014年，AndreasSchmid课题组成功的在大肠杆菌中从头合成了2.7g/L的(-)-柠檬烯(Biotechnol.J.,2014,9:1000-1012)，因此目前微生物的(-)-薄荷醇途径的瓶颈在于柠檬烯-3-羟化酶(L3H)和异薄荷烯醇脱氢酶(IPDH)。异薄荷烯醇脱氢酶(IPDH)隶属于SDR超家族。该类酶可以催化异薄荷烯醇氧化成相应的酮。该酶最初是在薄荷属植物中被发现的(ArchivesofBiochemistry&Biophysics,1985,238:49-60)，其既能够催化异薄荷烯醇(isopiperitenol)氧化，也能催化香芹醇(carveol)氧化，因此该酶也被称为异薄荷烯醇/香芹醇脱氢酶(PlantPhysiology,2004,136:4215-4227)。2005年，胡椒薄荷中的该酶成功地在大肠杆菌中异源表达并表征，但其活力极低，kcat/Km仅0.027s-1·mM-1。除此之外，该酶也被发现存在于其他植物(Biol.Pharm.Bull.,2014,37:847-852)、微生物(JournalofBiologicalChemistry,1999,274:26292-26304)、真菌(FungalBiology,2017,121:137-144)之中。但这些异薄荷烯醇脱氢酶大部分都并未对底物异薄荷烯醇进行表征，且目前该酶的晶体结构尚未被解析。已知IPDH除了在(-)-薄荷醇微生物合成途径中有重要作用之外，也为未来合成异薄荷烯酮提供了新的方法。异薄荷烯酮可以作为警告螨虫远离的“报警素”(AgriculturalandBiologicalChemistry,1987,51:3441-3442)，是生物界重要的物质，虽然目前它的其他应用不明，但其更多的应用会随着异薄荷烯酮合成方法的改善而被发现。迄今为止，异薄荷烯酮的制备研究进展尚浅，目前仅有化学合成法存在，比如通过钌、吡咯的络合物将(-)-柠檬烯氧化成(-)-异薄荷烯酮(TheJournalofOrganicChemistry,1999,64:7365-7374)。唯一达到克级别的制备是NigelS.Scrutton所在课题组所用的方法(J.Nat.Prod.,2018,81:1546-1552)，但其产率仅35％。总之，目前酶法合成异薄荷烯酮的方法暂未出现。综上所述，在(-)-薄荷醇微生物合成途径以及异薄荷烯酮的制备中，IPDH都占据着重要地位，但已知的异薄荷烯醇脱氢酶MpIPDH存在着催化活性低，以膜蛋白形式存在，时空得率低等问题。因此，需要催化性能更好的酶催化剂来满足微生物中高效薄荷醇合成途径的需求，以及酶法合成异薄荷烯酮的需求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术中异薄荷烯醇脱氢酶的不足，提供一种催化性能明显改善的醇脱氢酶突变体。本专利技术的技术方案之一，获得催化性能明显改善的醇脱氢酶突变体。首先在NCBI的细菌库以已报道的MpIPDH(PlantPhysiology,2005,137:863-872,NCBINumber:Q5C919.1)为探针进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种醇脱氢酶突变体，其特征在于，是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的95位谷氨酸、97位谷氨酸、154位甲硫氨酸、189位缬氨酸、191位天冬氨酸、194位甲硫氨酸、195苯丙氨酸、199位酪氨酸、208位苯丙氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质，同时，所述衍生蛋白质具有高于SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和稳定性。/n
【技术特征摘要】
1.一种醇脱氢酶突变体，其特征在于，是将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的95位谷氨酸、97位谷氨酸、154位甲硫氨酸、189位缬氨酸、191位天冬氨酸、194位甲硫氨酸、195苯丙氨酸、199位酪氨酸、208位苯丙氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列对应的蛋白质，同时，所述衍生蛋白质具有高于SEQIDNo.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和稳定性。
2.如权利要求1所述的醇脱氢酶突变体，其特征在于，其是由下述任一氨基酸序列组成的蛋白质：
(1)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第95位谷氨酸替换为缬氨酸；
(2)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第95位谷氨酸替换为苯丙氨酸；
(3)将如SEQIDNo.1所示氨基酸序列的第97位谷氨酸替换为甲硫氨酸；
(4)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第154位甲硫氨酸替换为组氨酸；
(5)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第189位缬氨酸替换为色氨酸；
(6)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第189位缬氨酸替换为异亮氨酸；
(7)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第191位天冬氨酸替换为缬氨酸；
(8)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第194位甲硫氨酸替换为赖氨酸；
(9)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第194位甲硫氨酸替换为天冬酰胺；
(10)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第195位苯丙氨酸替换为色氨酸；
(11)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第195位苯丙氨酸替换为甲硫氨酸；
(12)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第199位酪氨酸替换为缬氨酸；
(13)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第199位酪氨酸替换为组氨酸；
(14)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第95位谷氨酸替换为缬氨酸，第208位苯丙氨酸替换为组氨酸；
(15)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列的第97位谷氨酸替换为甲硫氨酸，第154位甲硫氨酸替换为组氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：李春秀，占静茹，寿超，陈琦，许建和，潘江，钱小龙，
申请(专利权)人：华东理工大学，苏州百福安酶技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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