高产头孢菌素C的基因工程菌构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种高产头孢菌素C的基因工程菌构建方法及其应用，涉及头孢菌素C的制备技术领域，本发明专利技术通过对产黄枝顶头孢霉内源性脂肪酶基因进行过量表达，提高CPC发酵过程中的脂肪酶活力，促进豆油中的甘油三酯水解为脂肪酸等分子，从而提高CPC发酵产量，本发明专利技术公开的产黄枝顶头孢霉脂肪酶基因AclipA能够有效地调节产黄枝顶头孢霉菌的头孢菌素C的合成速率和产量。利用本发明专利技术的产黄枝顶头孢霉脂肪酶基因AclipA及其编码的蛋白质能够有效提高产黄枝顶头孢霉菌对发酵原料豆油的利用效率，促进头孢菌素C的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
高产头孢菌素C的基因工程菌构建方法及其应用
本专利技术涉及基因工程菌
，特别是一种高产头孢菌素C的基因工程菌构建方法及其应用。
技术介绍
头孢菌素C（CephalosporinC，英文缩写CPC）是自然界中发现的第二种β-内酰胺类抗生素，也是生产头孢类抗生素重要中间体7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的主要原料。CPC能够抑制细菌细胞壁合成，但其抗菌活性较低。同时因其对人体安全无毒而获得了广泛关注和研究。目前，工业上主要利用产黄枝顶头孢霉（Acremoniumchrysogenum）发酵生产CPC。经过多年研究，CPC在产黄枝顶头孢霉中的生物合成途径已经研究清楚，且产黄枝顶头孢霉的遗传操作系统已经相对成熟，这为利用基因工程手段改造这一重要的工业真菌奠定了良好基础。目前，工业上生产CPC主流工艺是采用葡萄糖和豆油等植物油作为产黄枝顶头孢霉的复合碳源。CPC发酵初期，葡萄糖等快速利用碳源为菌体自身生长提供必要营养物质；由于受到葡萄糖效应的限制，发酵后期当菌体生长到一定程度后，往往通过流加豆油等植物油作为迟效碳源，为菌体合成次级代谢产物继续提供碳骨架。两种碳源结合使用同时带来了问题，但随着大宗作物原料价格的提高，豆油作为CPC主要发酵原料的成本越来越高，而实际生产时发现豆油利用不完全，浪费严重。此外，由于发酵菌种对豆油利用度不高而造成后续发酵残液COD值含量高，增加企业后期对发酵残液进行环保处理的压力。植物油的主要成分是甘油三脂，而甘油三酯一般不能作为微生物的直接碳源。植物油经外源添加脂肪酶分解后产生脂肪酸、甘油、甘油单酯和甘油二酯等。豆油中甘油三酯的主要成分是亚油酸和油酸这两种不饱和脂肪酸（含量能占到总脂肪酸的70%~80%）以及甘油。已有研究表明，以油酸或亚油酸作为碳源部分或完全替代豆油不仅能够促进产黄枝顶头孢霉生长，而且促进CPC合成代谢并进一步高产。然而，油酸和亚油酸作为功能性脂肪酸的价格过高是阻碍不饱和脂肪酸替代豆油工艺工业化的根本原因。因而，有人通过向豆油中添加脂肪酶（Lipase）将甘油三酯水解为脂肪酸的方式进行CPC发酵，并起到促进CPC进一步高产的效果。然而，这种方式同样缺点明显。首先是外源脂肪酶的添加进一步增加CPC生产的成本；其次是需要在CPC生产工艺中增加豆油酶解工艺和酶解罐等设备，且酶解工艺不易控制。近年来对CPC发酵过程中豆油的作用和代谢机制也发现，发酵液中脂肪酶活性的高低是影响CPC产量的关键。发酵液中的豆油首先被产黄枝顶头孢霉自身分泌的胞外脂肪酶酶解，产生脂肪酸混合液和甘油。脂肪酸进入细胞内部后，经过β-氧化产生乙酰辅酶A后进入三羧酸循环，并可产生多种氨基酸用于菌体生长和CPC等次级代谢产物的合成，其中包括合成CPC的3种氨基酸前体（L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸）；甘油则主要进入糖酵解途径转化为丙酮酸，最终代谢产生相应的氨基酸或进入三羧酸循环。这可能是添加了酶解豆油后，菌丝体内的脂肪滴数量增多并加快了菌体的分化。在此前的研究中发现，野生型产黄枝顶头孢霉菌体合成的脂肪酶有限，发酵结束后发酵液中有大量油脂残留。由此可见，豆油酶解效率直接影响CPC合成速率。因此，我们从提高豆油酶解效率的角度出发，优化了豆油的酶解方案，希望通过提高产黄枝顶孢自身豆油酶解能力从而提高CPC的合成效率和产量。
技术实现思路
为了克服上述不足，本专利技术提出对产黄枝顶头孢霉内源性脂肪酶基因进行过量表达，提高CPC发酵过程中的脂肪酶活力，促进豆油中的甘油三酯水解为脂肪酸等分子，从而提高CPC发酵产量。为达到上述目的，本专利技术首先提出一种高产头孢菌素C的基因工程菌。上述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉的内源性脂肪酶AclipA基因进行过量表达获得，所述脂肪酶AclipA的核苷酸序列如序列表中SEQID:No1所示；上述基因工程菌中，所述脂肪酶AclipA的氨基酸序列如SEQID:No2所示；本专利技术提供一种分离的核酸，所述核酸为由序列表中SEQID:No1所示核苷酸序列组成的核酸或序列表中SEQID:No2所示氨基酸序列组成的蛋白质；专利技术所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码产黄枝顶头孢霉脂肪酶的DNA核酸，通过基因克隆技术获得编码产黄枝顶头孢霉脂肪酶AclipA的DNA核酸，或者通过人工全序列合成的方法得到编码产黄枝顶头孢霉脂肪酶AclipA的核酸。脂肪酶AclipA的基因全长序列如序列表中SEQID:No1所示。如本领域技术人员所知：编码SEQID:No2所示的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个核酸的同系物。本专利技术中核酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。其中所述含有突变点的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳的为人工合成。利用本专利技术所述PCR引物进行PCR扩增程序，即得编码所述产黄枝顶头孢霉脂肪酶AclipA的DNA核酸分子。本专利技术提供一种分离的蛋白质，其是由序列表中SEQID:No2所示氨基酸序列组成的蛋白质；本专利技术所述分离的蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的表达转化子中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得；具有序列表中SEQID:No2所示氨基酸序列的蛋白质命名为产黄枝顶头孢霉脂肪酶。本专利技术提供一种包含上述DNA核酸的重组表达载体。其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，将本专利技术所述的编码产黄枝顶头孢霉脂肪酶的基因核酸分子连接于各种表达载体上构建而成；本专利技术所述的表达载体为本领域常规的各种载体；所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选地为质粒pBARGPE1-Hygro。一种包含上述重组表达载体的重组表达转化子。本专利技术所述重组表达转化子的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的脂肪酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)或大肠杆菌菌株DH5α。将前述重组表达质粒转化至大肠杆菌DH5α中，即可得本专利技术优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法、农杆菌介导转化法、热激法或电转法。含有上述的DNA核酸或如上所述的重组表达载体在制备CPC中的应用，含有上述的蛋白质或如上所述的重组表达转化子在制备头孢霉素C中的应用也属于本专利技术的保护范围。高产头孢菌素C的基因工程菌的构建方法，包含权利要求1或2所述的基因工程菌，培养得到头孢菌素C的步骤。上述方法中，所述培养方法包括以下步骤：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得，将转化所得宿主微生物在25℃~40℃，震荡培养4~6d得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得；本专利技术所述的宿主微生物为本领域常规使用的产黄本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高产头孢菌素C的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉的内源性脂肪酶

【技术特征摘要】
1.高产头孢菌素C的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉的内源性脂肪酶AclipA基因进行过量表达获得，所述脂肪酶AclipA的核苷酸序列如序列表中SEQID:No1所示。


2.如权利要求1所述的高产头孢菌素C的基因工程菌，其特征在于，所述脂肪酶AclipA的氨基酸序列如SEQID:No2所示。


3.权利要求1或2所述的高产头孢菌素C的基因工程菌中脂肪酶AclipA的核酸分子。


4.权利要求2所述的高产头孢菌素C的基因工...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁恒宇，韩超，熊琼超，李雪亮，王世超，周鹏，
申请(专利权)人：河南省健康元生物医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41