一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体及其构建方法。在一个方面，本发明专利技术提供一种构建基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体的方法，所述方法包括将野生型黑猩猩ChAd63型腺病毒全基因组序列，即SEQ ID NO:1所示序列中的E1、E3和E4区功能性删除。在另一方面，本发明专利技术提供一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体，其根据上述方法构建。其根据上述方法构建。其根据上述方法构建。

【技术实现步骤摘要】
一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体及其构建方法


[0001]本专利技术属于生物技术和病毒学领域；更具体而言，本专利技术涉及一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体及其构建方法。

技术介绍

[0002]腺病毒隶属于腺病毒科，系中等大小(直径70-90nm)的非包膜双链DNA病毒。上世纪五十年代，腺病毒在人腺体中首次被分离出来(Rowe et al. 1953)。此后的四十年间，腺病毒载体被广泛应用于基因治疗、溶瘤病毒和疫苗研发中(Chen et al. 2016)。截至2019年，全球共获批上市了四个腺病毒相关的产品，包括一个针对腺病毒4型和7型感染的减毒口服疫苗(Adenovirus Type 4 and Type 7 Vaccine, Live, Oral，美国)，重组人5型腺病毒注射液(安柯瑞)、重组人p53腺病毒注射液(今又生)和重组埃博拉病毒腺病毒载体疫苗(Pearson et al. 2004, Wu et al. 2017)。此外，全球共有超过200个腺病毒载体相关的临床试验在进行。基于腺病毒的医药产品在基因治疗、肿瘤治疗和疫苗研发领域已经发挥了越来越重要的作用，开发基于腺病毒载体的产品具有重要的意义。
[0003]腺病毒的基因组约30-40kb大小，编码30-40个基因，分为早期基因和晚期基因。目前已分离和鉴定超过一百种腺病毒血清型 (Alonso-Padilla et al. 2016)。基于腺病毒开发的病毒载体具有以下优点：1)由于腺病毒感染细胞之后，其基因组可以进入细胞核，因此腺病毒载体的外源抗原可以通过内源蛋白加工途径刺激较强的CD8+ T细胞反应和抗体反应；2)改造后的复制缺陷型腺病毒具有很好的安全性；3)腺病毒基因组不整合到宿主基因组中；4)腺病毒对多种类型的细胞具有侵染性；4)腺病毒载体可以装载最大8kb的外源基因；5)腺病毒载体在体内表达外源基因的时效性更长；6)腺病毒的扩增纯化工艺成熟，可以获得较高滴度的病毒颗粒(Vannucci et al. 2013)。
[0004]临床试验中使用最多的腺病毒载体类型为人腺病毒5型(HuAd5)，包括在中国获批上市的三个腺病毒相关产品，也均以HuAd5型作为载体。但40-60%的人由于曾被HuAd5自然感染，体内已存在针对病毒载体的中和性抗体，而预存的抗体将极大抑制外源基因的表达效率和增加载体介导的细胞毒性(Xiang et al. 2002, Peruzzi et al. 2009)。目前普遍采用改造稀有人腺病毒血清型(26、35等)或使用非人灵长类来源的腺病毒血清型作为疫苗载体以克服人群中预存免疫对疫苗产品效果的影响。例如，由于人体中不含有针对黑猩猩腺病毒的中和抗体，基于黑猩猩腺病毒作为表达载体开发产品，其效果将可能显著优于人血清型腺病毒载体。而且，越来越多的基于黑猩猩腺病毒载体所开发的产品在临床上也显示出极好的安全性。
[0005]目前构建重组腺病毒载体的方法有两种：同源重组法和直接克隆法。同源重组法通常至少需要两个质粒，一个穿梭质粒携带目的基因，另一个骨架质粒包含病毒组装所需要的基因组序列。将两种质粒在真核细胞或大肠杆菌中通过反向重复序列或特定的重组酶系统完成同源重组获得重组病毒或重组腺病毒载体，如AdMax体系或AdEasy体系。该方法的缺点是重组效率低，容易受到亲代病毒污染，步骤比较繁琐。目前虽然可较便捷使用基于人
HuAd5型的商用载体系统，但一方面由于专利限制无法进行很多产品开发，且由于很多新型腺病毒还未建立商业的骨架载体，十分耗时耗力(Miravet et al. 2014)。直接克隆法是通过分子克隆手段将野生型腺病毒基因组改造并克隆至质粒载体上，再通过线性化转染至细胞系以拯救出病毒。该方法的缺点是由于腺病毒基因组较大(约36kb)，分子克隆存在相当大的难度(Zhou et al. 2010, Yang et al. 2016)。而且，由于野生型腺病毒的获取通常具备相当大的难度(如，无法购买、分离困难等)，也极大限制了该方法的使用。
[0006]相反，本专利技术所阐述的方法很好地解决了目前构建重组腺病毒载体所面临的以上问题。所述方法具有更加简单、精确、质量可控、成本可控、时间更短、序列无突变风险、无需先获得野生型菌株从而更具普遍适用性等优点。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体及其构建方法。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供一种构建基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体的方法，所述方法包括将野生型黑猩猩ChAd63型腺病毒全基因组序列(GenBank，# MS912777.1)，即SEQ ID NO: 1所示序列中的E1、E3和E4区功能性删除。
[0009]在一个具体实施方案中，将E1区中对应于SEQ ID NO: 1所示序列576-3128位的核苷酸，即SEQ ID NO: 3所示序列删除；将E3区中对应于SEQ ID NO: 1所示序列27917-31786位的核苷酸，即SEQ ID NO: 4所示序列删除；和将E4区中对应于SEQ ID NO: 1所示序列33825-36215位的核苷酸，即SEQ ID NO: 5所示序列删除并替换为SEQ ID NO: 2所示的黑猩猩腺病毒ChAd68型全基因组序列的E4 ORF6表达框序列。优选地，所述E4 ORF6表达框序列为SEQ ID NO: 8所示序列。
[0010]在进一步的实施方案中，将含有酶切位点的序列插入被删除的E1区中。优选地，所述含有酶切位点的序列为包含一个或多个选自AsiSI、I-CeuI、MluI、EcoRI、PI-SceI的酶切位点的序列。更优选地，所述含有酶切位点的序列为SEQ ID NO: 6所示序列。
[0011]备选或另外地，将含有酶切位点的序列插入被删除的E3区中。优选地，所述含有酶切位点的序列为包含HpaI和/或PacI的酶切位点的序列。更优选地，所述含有酶切位点的序列为SEQ ID NO: 7所示序列。
[0012]在进一步的实施方案中，将外源基因插入被删除的E1、E3和E4区的一个或多个区中。优选地，所述外源基因为EGFP或mCherry。优选地，将EGFP插入被删除的E1区中；或者将EGFP和mCherry分别插入被删除的E1和E3区中。
[0013]在进一步的实施方案中，所述方法还包括加入线性化酶切位点，并插入至原核复制质粒。优选地，所述线性化酶切位点为SwaI酶切位点。优选地，所述原核复制质粒的序列如SEQ ID NO: 9所示。
[0014]在本专利技术的第二方面，提供一种基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体，其根据前述实施方案中任一个所述的方法构建。
[0015]在一个实施方案中，所述表达载体包含修饰的SEQ ID NO: 1所示序列，其中E1、E3和E4区被功能性删除。
[0016]在一个具体实施方案中，E1区中对应于SEQ ID NO: 1所示序列576-3128位的核苷<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种构建基于黑猩猩ChAd63型腺病毒的表达载体的方法，所述方法包括将SEQ ID NO: 1所示序列中的E1、E3和E4区功能性删除。2. 根据权利要求1所述的方法，其中将E1区中对应于SEQ ID NO: 1所示序列576-3128位的核苷酸删除；将E3区中对应于SEQ ID NO: 1所示序列27917-31786位的核苷酸删除；和将E4区中对应于SEQ ID NO: 1所示序列33825-36215位的核苷酸删除并替换为SEQ ID NO: 2所示的黑猩猩腺病毒ChAd68型全基因组序列的E4 ORF6表达框序列。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述E4 ORF6表达框序列为SEQ ID NO: 8所示序列。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将含有一个或多个选自AsiSI、I-CeuI、MluI、EcoRI、PI-SceI的酶切位点的序列插入被删除的E1区中；和/或将含有HpaI和/或PacI的酶切位点的序列插入被删除的E3区中。5.根据权利要求4所述的方法，其中将含有MluI和EcoRI的酶切位点的序列插入被删除的E1区中。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其中将SEQ ID NO: 6所示序列插入被删除的E1区中。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张超，刘海涛，侯永凡，张玲莉，周晨亮，周东明，刘革，史力，莫呈钧，张智，
申请(专利权)人：怡道生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：