一种可提高番茄中辅酶Q制造技术

本发明专利技术涉及一种可提高番茄中辅酶Q

【技术实现步骤摘要】
一种可提高番茄中辅酶Q
10
含量的联合载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及植物
，尤其涉及一种可提高番茄中辅酶Q
10
含量的联合载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]辅酶Q
10
(Coenzyme Q
10
，又名CoQ
10
)的分子结构由苯醌母基团和一条十聚异戊烯侧链的醌类组成。辅酶Q
10
在人体内主要是作为氧化呼吸链中复合体II/III的电子转运体，帮助细胞产生ATP。此外它也是一种膜上的抗氧化物质，被用作许多酶的辅助因子。在人体内，缺乏辅酶Q
10
会导致各种严重的神经性疾病，如线粒体脑肌病、小脑共济性失调或Leigh氏脑病等，并影响如骨骼肌、心脏和肾脏等多个器官的功能。一般情况下，辅酶Q
10
水平会随着人年龄的增长而降低，并且在服用某些药物(如他汀类药物)和患有心血管疾病的情况下，辅酶Q
10
含量会异常减少。
[0003]目前辅酶Q
10
生产主要是通过微生物(酵母等)合成。考虑到食品安全问题，从工程酵母或细菌细胞中提取的辅酶Q
10
并不能完全适用于食品添加，而从植物中提取辅酶Q
10
可以有效避免这一问题。但由于植物中辅酶Q
10
含量过低，需要通过一定的分子生物学方法提高作物中辅酶Q
10
含量。由于目前植物中辅酶Q
10<br/>合成途径尚未完全解析，还未有成功在作物中提高辅酶Q
10
的报道。
[0004]而从饮食中获得外源辅酶Q
10
，对于维持体内辅酶Q
10
水平稳定具有非常重要的意义。在我们的饮食结构中，肉类、鱼类和油中通常含有丰富的辅酶Q
10
(约为0.12mg/g)，但蔬菜和水果中的辅酶Q
10
含量相对较低(小于0.02mg/g)。在如今社会提倡增加蔬菜水果饮食结构比例的观念影响下，维持食物中辅酶Q
10
的稳定摄入变得极为困难。为了满足日常营养摄入的需要，人们对富含辅酶Q
10
的植物性食品抱有极大的需求。因此提高作物中辅酶Q
10
含量的专利技术具有实际的生产价值和明确的转化前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种可提高番茄中辅酶Q
10
含量的联合载体及其构建方法和应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：
[0007]本专利技术的第一方面是提供一种可提高番茄中辅酶Q
10
含量的联合载体构建方法，步骤包括：
[0008]S1、提取番茄基因组DNA，通过PCR扩增获得E8启动子序列；通过全合成获得烟草Coq2基因编码序列，如SEQ ID NO.1所示；提取烟草基因组RNA，通过反转录获得cDNA，再通过PCR扩增获得DPS基因编码序列，如SEQ ID NO.2所示；通过全合成获得拟南芥HMGR2基因编码序列，如SEQ ID NO.3所示；通过全合成获得N端融合了番茄叶绿体信号肽的大肠杆菌UbiC基因编码序列，如SEQ ID NO.4所示；提取拟南芥基因组DNA，通过PCR扩增获得hsp终止
子序列；
[0009]S2、通过Golden Gate克隆法将所述E8启动子序列连入载体pUAP1，以获得E8启动子的level 0载体；通过Golden Gate克隆法将所述Coq2基因编码序列连入另一载体pUAP1，以获得Coq2基因的level 0载体；通过Golden Gate克隆法将所述DPS基因编码序列连入另一载体pUAP1，以获得DPS基因的level 0载体；通过Golden Gate克隆法将所述HMGR2基因编码序列连入另一载体pUAP1，以获得HMGR2基因的level 0载体；通过Golden Gate克隆法将所述UbiC基因编码序列连入另一载体pUAP1，以获得UbiC基因的level 0载体；通过Golden Gate克隆法将所述hsp终止子序列连入另一载体pUAP1，以获得hsp终止子的level 0载体；
[0010]S3、通过Golden Gate克隆法将所述E8启动子序列、所述Coq2基因编码序列和所述hsp终止子序列依次连入载体pICH47742，以获得Coq2基因的level 1载体；通过Golden Gate克隆法将所述E8启动子序列、所述DPS基因编码序列和所述hsp终止子序列依次连入载体pICH47751，以获得DPS基因的level 1载体；通过Golden Gate克隆法将所述E8启动子序列、所述HMGR2基因编码序列和所述hsp终止子序列依次连入载体pICH47761，以获得HMGR2基因的level 1载体；通过Golden Gate克隆法将所述E8启动子序列、所述UbiC基因编码序列和所述hsp终止子序列依次连入载体pICH47772，以获得UbiC基因的level 1载体；
[0011]S4、通过Golden Gate克隆法将35S启动子序列、潮霉素抗性基因编码序列和35S终止子序列，所述E8启动子序列、所述Coq2基因编码序列和所述hsp终止子序列，所述E8启动子序列、所述DPS基因编码序列和所述hsp终止子序列，所述E8启动子序列、所述HMGR2基因编码序列和所述hsp终止子序列，所述E8启动子序列、所述UbiC基因编码序列和所述hsp终止子序列依次连入载体pICSL4723-P1，所获得的level 2载体即为所述联合载体，如SEQ ID NO.5所示。
[0012]优选地，步骤S1中各所述的PCR扩增体系均为：模板，即500ng所述基因组DNA或50ng所述cDNA；0.2μM正向引物；0.2μM反向引物；10μL Fastpfu缓冲液；0.2mM dNTPs；2.5units Fastpfu DNA聚合酶；H2O补足至50μL；
[0013]PCR扩增程序均为：95℃，2min；95℃，20s、58℃，20s、72℃，2min，循环33次；72℃，5min。
[0014]优选地，番茄基因组DNA的PCR扩增引物如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；烟草cDNA的PCR扩增引物如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；拟南芥基因组DNA的PCR扩增引物如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。
[0015]优选地，通过所述全合成获得相应基因编码序列时，修改其中部分的碱基以去除BsaI和BpiI酶切位点。
[0016]优选地，步骤S2中各所述的level 0载体构建体系均为：100ng pUAP1载体；步骤S1中所获得的相应序列片段，与所述pUAP1载体的摩尔比为2:1；5units BpiI内切酶；200units T4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
BSA，1mg/mL；H2O补足至20μL；反应程序均为：37℃，3min、16℃，4min，循环26次；80℃，5min；反应结束后，取反应液转化大肠杆菌DH10B热击感受态，在含氯霉素的LB固体培养基上生长；挑选阳性克隆，LB液体培养基培养，提质粒，测序后获得相应正确的level 0载体。6.根据权利要求1所述的联合载体构建方法，其特征在于，步骤S3中各所述的level 1载体构建体系均为：相应的level 1载体，100ng；步骤S2中所获得的E8启动子的level 0载体，与所述相应的level 1载体的摩尔比为2:1；步骤S2中所获得的相应基因的level 0载体，与所述相应的level 1载体的摩尔比为2:1；步骤S2中所获得的hsp终止子的level 0载体，与所述相应的level 1载体的摩尔比为2:1；5units BsaI内切酶；200units T4连接酶；1.5μL T4连接酶缓冲液；1.5μL BSA，1mg/mL；H2O补足至20μL；反应程序均为：37℃，3min、16℃，4min，循环26次；80℃，5min；反应结束后，取反应液转化大肠杆菌DH10B热击感受态，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上生长；挑选阳性克隆，LB液体培养基培养，提质粒，测序后获得相应正确的level 1载体。7.根据权利要求1所述的联合载体构建方法，其特征在于，步骤S4中所述的level 2载体构建体系均为：100ng pICSL4723-P1载体；pICSL11059载体，与所述pICSL47...

【专利技术属性】
技术研发人员：许晶晶，范航，陈晓亚，杨蕾，
申请(专利权)人：上海辰山植物园，
类型：发明
国别省市：