基于抗原抗体作用的立体结构信息设计新型药物分子的方法技术

本发明专利技术涉及基于抗原抗体作用的立体结构信息进行新型药物分子设计的方法。具体而言，本发明专利技术通过在计算机上构建抗原和抗体可变区的理论构象，在此基础上建立抗原－抗体复合物的理论构象，识别抗原中与抗体结合的表位，并通过实验验证该表位，根据该表位的序列设计新的药物分子。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基于抗原抗体作用的立体结构信息进行新型药物分子设计的方法。具体而言，本专利技术通过在计算机上构建抗原和抗体可变区的理论构象，在此基础上建立抗原-抗体复合物的理论构象，识别抗原中与抗体结合的表位，并通过实验验证该表位，根据该表位的序列设计新的药物分子。本专利技术中使用的抗原实例是肿瘤坏死因子(TNF-α)，抗体实例是从杂交瘤细胞中筛选获得的抗TNF单克隆抗体Z12，利用这一对抗原抗体相互作用区域的构象及结构信息，借助计算机辅助设计的方法，获得替代抗体Z12的短肽分子。
技术介绍
由于蛋白质类药物制备难度大，需要更多的分子生物学技术、手段，同时由于难以释放、吸收，在用药过程中只能通过注射的方式进行。蛋白质类药物分子量大、柔韧性大，存在多个不同的结合表位，在治疗的同时可能会激活其它致病基因而产生意想不到的副作用。抗体类药物作为近年来发展迅猛的蛋白药物，已引起人们的广泛关注。然而，鼠源抗体引发的“人抗鼠抗体(HAMA)”反应限制了其临床应用；人鼠嵌合抗体在长期给药的过程中可以引发人抗嵌合抗体(HACA)反应；利用人-人杂交瘤技术制备的单克隆抗体尽管能克服了上述鼠源抗体及嵌合抗体的缺点，但是人单抗的制备存在产量低、不稳定、亲和力低等问题，以致于不能达到相应的治疗目的。更为重要的是，在治疗类风湿关节炎(RA)等疾病时，一次剂量需要1-10mg/kg抗TNF抗体或16mg/m2可溶性受体，疗程需持续几个月至半年以上。由于用药量大，蛋白质类药物的副作用就更加明显。E Fintan Walton(精通广泛生物
的专家)曾指出，“从重组蛋白获得具有轰动性的药物的机会是十分有限的”。蛋白质难于制备，难于释放，并且容易产生副作用，而小分子药物具有专一性，能够以片剂、胶囊形式存在，使得小分子药物替代蛋白分子成为当前分子设计、合理药物设计的热点，Moffat A S于1993年即提出“回到小分子化合物合成时代(Going back to the future with small syntheticcompounds)”。近年来发展迅猛的计算机辅助药物设计，无论是理论、技术，还是相关的方法都具备了相当雄厚的基础，并有效地服务于实验，为新药设计和合成提供依据、理论思路，同时也缩短了新药的研发周期。结合计算机药物辅助设计方法，无疑将加速具有特定靶向的先导化合物的研发，大大提高新药研制的成功率。利用计算机辅助药物设计方法获得候选化合物进入临床研究的成功小分子药物很多，如Hoffmann La Roche公司利用凝血酶的晶体结构模型，优化候选化合物在酶催化中心的疏水区域结构，设计、获得凝血酶抑制剂Ro46-6240，现已进入抗凝血的临床实验；Merck研究室综合运用碳酸酐酶(CA)的晶体结构和量子化学构象分析，确定已知CA抑制剂与CA结合的活性构象，在此基础上进行结构改造获得Trusopt(MK-507)，现在已作为治疗青光眼疾病的药物上市。目前，国际上基于蛋白质空间构象设计小分子化合物取得较大的进展，然而利用抗原-抗体复合物模型设计抗体模拟物才刚刚开始。Takahashi M等借助抗原结合抗体高变区(CDR)位点，利用计算机辅助设计获得了卟啉结合肽，经实验验证具有生物学功能；利用二维1H核磁共振技术揭示12肽与卟啉结合的构象特征，利用计算机辅助设计、构建更短肽段-9肽，并最终获得成功。国内近年来也开展了基于大分子结构设计小分子药物，并在理论模型、计算方法上取得了一定的进展，与国际上在该方面的研究接轨。然而基于抗原-抗体作用复合物，针对抗原表位-抗体高变区CDR作用模式设计小分子药物却尚未开展。hTNF-α是由单核细胞与巨噬细胞产生的具有多功能的细胞因子，能够杀伤或抑制肿瘤细胞，具有提高中性粒细胞吞噬能力等重要的生物学活性。但是，近年来随着对hTNF-α生物学活性研究的深入，发现各种原因引发的感染性休克、炎症、自身免疫性疾病均表现为TNF表达水平过高，大量的研究结果表明，TNF-α参与诸如脓毒症、感染、自身免疫疾病、移植物排斥、移植物抗宿主病等多种人类疾病。因此，关于hTNF-α拮抗物及其机理的研究逐步深入，尤其是抗TNF抗体对动物模型的效应研究和临床研究更是方兴未艾。由于hTNF-α在人体免疫紊乱中的有害作用，目前已着手设计治疗策略以抑制或抵消hTNF-α的活性。其中，国内外正在开展的寻找中和hTNF-α的抗体、可溶性TNF受体作为抑制hTNF-α活性的手段具有更广泛的发展前景。近年来，抗hTNF-α抗体、可溶性TNF受体已获得FDA批准，并用于治疗RA、节段性回肠炎。相对于早期的治疗药物(如DMARD)，获得FDA批准的抗hTNF-α抗体、可溶性TNF受体具有更优的治疗效果，耐受性、临床缓解作用更佳。大量的分子生物学实验表明，不论是中和抗体，还是可溶性hTNF-α受体，只要能够阻断TNF活性，对上述疾病就有一定的治疗作用。该专利技术选择TNF-α作为研究对象，结合本实验室近十年来在TNF抗体方面的分子生物学研究成果，有针对性地通过计算机辅助设计方法构建抗体与hTNF-α作用的复合物模型；通过分子生物学实验，结合理论模拟确定的结构数据修正研究，进而利用同源模建、分子对接理论设计修饰复合物模型；结合分子动力学方法动态模拟复合物作用构象的变化，确定抗体结合的抗原表位空间构象特征；通过全新药物设计的方法合理设计TNF抗体模拟肽。
技术实现思路
本专利技术的基于抗原-抗体作用的立体结构信息设计新型药物分子的方法，包括以下步骤(1)基于抗原和抗体的一级结构序列，构建抗原和抗体可变区的理论构象；(2)根据抗原和抗体可变区的理论构象，构建抗原-抗体复合物的理论构象；(3)识别抗原中结合抗体的表位；(4)实验验证抗原中结合抗体的表位； (5)根据上述表位的序列，设计能够影响其与抗体结合的分子。本专利技术采用以结构生物学、分子生物学、生物信息学相结合的方法，以TNF-α为实例，理论与实验相结合确定抗体Z12特异性识别的TNF-α抗原表位。针对从杂交瘤细胞筛选获得的具有中和活性的抗体Z12，结合TNF-α晶体结构，利用同源模建、分子对接的方法获得抗原-抗体作用的复合物理论模型。通过计算机图形学技术，借助分子间氢键形成理论、反应自由能理论、泛德华作用及静电作用从理论上初步确定抗体Z12特异性识别TNF-α抗原表位的空间结构。利用分子生物学技术，设计TNF-α缺失突变体，通过ELISA、Western-Blot等生物学手段进行检测，从而从实验中确定理论预测结果的可靠性。本专利技术通过上述方法证实理论预测的正确性，并确定Z12抗体识别TNF-α抗原表位的位置。本专利技术借助确定的Z12特异性识别TNF-α的表位结构及物理化学性质特征，利用计算机辅助分子设计原理，从理论上设计能够模拟抗体Z12的短肽。利用生物学手段，对短肽进行生物学评价。本专利技术通过上述策略获得了对抗原(TNF-α)-抗体(Z12)的特异性结合具有显著抑制作用的Z12拮抗肽。本专利技术的方法可参见所附流程图(图7)。附图说明图1.1抗体Z12的RT-PCR扩增产物。其中MDL2000；1Fd片断基因2κ链基因。图1.2含Fd和κ链基因的重组子Z12的酶切鉴定。其中MDL2000；1pGEM-T E本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于抗原－抗体作用的立体结构信息设计新型药物分子的方法，包括以下步骤：（１）基于抗原和抗体的一级结构序列，构建抗原和抗体可变区的理论构象；（２）根据抗原和抗体可变区的理论构象，构建抗原－抗体复合物的理论构象；（３）识 别抗原中结合抗体的表位；（４）实验验证抗原中结合抗体的表位；（５）根据上述表位的序列，设计能够影响其与抗体结合的分子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈倍奋，冯建男，黎燕，张巍，
申请(专利权)人：北京四环医药科技股份有限公司，中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]