一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用技术方案

一种冠状病毒假病毒的包装系统，包括Fluc、EGFP双报告基因置换GP基因的水泡性口炎病毒VSV载体、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞，所述双报告基因选自荧光素酶和荧光蛋白，荧光素酶报告基因优选Fluc基因；上述包装系统采用一步法包装方法可快速包装出单周期感染、低背景值、高滴度、相较于慢病毒介导的假病毒系统具备检测快速特性的假病毒，可用于COVID‑19(SARS‑CoV‑2)、SARS(SARS‑CoV)、MERS等冠状病毒及其他病毒的研究；上述假病毒可通过病毒污染分布模型、搭建场景、取样检测的步骤的评估消杀剂效力，为消杀剂的评价提供安全、便捷、有效的工具方法，具备广泛的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种冠状病毒假病毒包装系统及其包装方法、冠状病毒假病毒在评估消杀效力中的应用
本专利技术涉及基因及细胞工程和病毒学领域，具体涉及假病毒包装载体及包装细胞系统，所述假病毒包装载体及包装系统通过一步法包装方法制备冠状病毒假病毒，所制备的冠状病毒假病毒可以作为生物指示剂用于抑制及消杀冠状病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价。
技术介绍
新冠病毒COVID-19是一种可使人类感染致命肺炎的病毒。除新冠病毒以外，自21世纪初以来，另外两种冠状病毒，即严重的急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)也在人类中造成致命的肺炎。此外，人类中还流行四种低致病性冠状病毒：HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63和HCoV-229E。国内多地相继确诊新冠病毒感染本土病例，并被证实新冠病毒主要依托冷链物流进行传播。病毒消杀灭活技术是一项传统的技术，根据原理可以简单分为物理、化学灭活方法。常见的病毒消杀剂包括臭氧、紫外光、二氧化氯、过氧乙酸、双氧水、二氯异氰尿酸钠、辐照、负离子等，品种繁多，但病毒灭活能力良莠不齐，适用范围缺乏数据支撑，其主要原因是缺乏统一有效的消杀剂灭活病毒能力评价方法。尤其是针对新冠(SARS-CoV-2)、急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)等具有极强的传播性、危害性的病毒，进行活病毒评价只能选择P3实验室操作。具备生物安全性的试验评价方法的缺失，直接导致适用的新技术或新应用如臭氧、辐照缺乏评价支撑，影响其参数、适用规律确定及推广应用。已知的假病毒是指一种复制缺陷的病毒能够整合另外一种不同种类病毒的包膜糖蛋白，形成的具有外源性病毒的包膜，而基因组保持着原病毒载体本身基因组特性的病毒。假病毒由于其核酸基因组缺陷而丧失了复制能力，仅具有单周期感染活性，因此具有较高的生物安全性。这对研究具有致病率高，传染性强、不易在体外培养的病毒如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)等提供了一种安全有效的研究方法。体外构建的假病毒还具有稳定性强、宿主嗜性广等优点，因此被广泛应用于疫苗的研发、评价，中和抗体检测、筛选、评价，中和抗体抗原表位的发现，抑制病毒入侵的抗体与大分子、小分子药物研发，以及物理消杀方法、化学消杀剂等方面的研究工作。包装制备无生物安全隐患的SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV等假病毒，并将其应用于检查、评价中和、抑制病毒能力及消杀剂灭活病毒的作用与效力具有重要意义。
技术实现思路
复制缺陷型、不能产生传染性子代的假病毒提供了一种安全、有效地模拟野生病毒侵染宿主过程的方法体系。VSV的组装发生在细胞膜上，涉及从细胞表面出芽的病毒离子。在出芽过程中，VSV获得一个由来自于细胞膜的双层脂质和由VSV糖蛋白(VSV-G)三聚体形成的包膜。当VSV-GP基因部分或全部被双报告基因置换，外源性病毒的包膜蛋白在rVSV-ΔG感染的细胞中充分表达时，外源病毒糖蛋白可以组装到VSV病毒颗粒的包膜上。本研究比较了全长COVID-19的S蛋白(COVID-19-S)，截短的S蛋白C末端(C19-HA)以及C末端19aa截短并融合HA(C19-HA)包装的假病毒VSVΔG-COVID-19-S-C19-HA，发现VSVΔG-COVID-19-S-C19-HA假病毒的感染效率远高于VSVΔG-COVID-19-S，同时也显著优于VSVΔG-COVID-19-S-C19，同时稳定表达人源ACE2(hACE2)的293T-hACE2细胞对假病毒感染最敏感。相比而言Vero-E6尽有中等的感染效率，而293T细胞对新冠假病毒完全不敏感。以VSVΔG-COVID-19-S-C19-HA和293T-hACE2细胞为基础，建立了抑制及消杀冠状病毒的生物、化学物质及物理处理方法效力的检测和评价方法(包括臭氧在冷链环境中消杀冠状病毒效力的评价)以及多种冠状病毒疫苗免疫后血清样本中抗体的中和活性评价。本方法体系可用于COVID-19(SARS-CoV-2)、SARS(SARS-CoV)、MERS等冠状病毒及其他病毒的研究。一种冠状病毒假病毒包装系统，包括改良型安全、高效水泡性口炎病毒VSV、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换部分或全部GP基因的复制缺陷病毒，所述改良型水泡性口炎病毒VSV命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP。优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述双报告基因包括荧光蛋白报告基因和荧光素酶报告基因，所述荧光蛋白报告基因选自绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白对应的报告基因；所述荧光素酶报告基因选自萤火虫荧光素酶或海肾荧光素酶对应的报告基因。优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述荧光蛋白报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP基因，对应基因序列为SEQIDNO：1；所述荧光素酶报告基因选自密码子优化的萤火虫荧光素酶Fluc基因，所述萤火虫荧光素酶Fluc基因的序列为SEQIDNO：2。优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP的遗传物质中编码GP的基因被Fluc报告基因置换，所述EGFP的报告基因整合在Fluc与VSV聚合酶L基因之间，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP具有SEQIDNO：3的基因序列。优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述装配细胞选自293T，所述装配细胞瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S，所述瞬时表达通过真核表达载体转染细胞实现，所述稳定表达通过慢病毒载体系统转导细胞实现，对应的所述诱导表达通过四环素调控tet-on/off载体系统转导细胞实现。优选的，所述一种冠状病毒假病毒包装系统，所述装配细胞表达的包膜蛋白对应冠状病毒SARS或MERS或COVID-19中的S基因，所述SARS冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基酸后对应的序列，即SEQIDNO：4序列；所述MERS冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基酸后对应的序列，即SEQIDNO：5序列；所述COVID-19冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白3’端缺失19个氨基酸后的序列，即SEQIDNO：6序列,或者所述COVID-19冠状病毒包膜蛋白选自其刺突蛋白S的3’端缺失19个氨基酸且同时融合HA蛋白后对应的序列，即SEQIDNO：7序列；所述装配细胞表达的包膜蛋白表达为瞬时表达质粒或稳定表达质粒或稳定及诱导表达慢病毒载体介导，包括真核表达载体,且在装配细胞中瞬时表达包膜蛋白的四种质粒分别命名为pCA-SARS-C19、pCA-MERS-C19、pCA-COVID-19-C19以及pCA-COVID-19-C19-HA的表达质粒以及表达相同编码蛋白的衍生载体。优选的，所述S-C19-HA中S的3’端19aa缺失后融合的对象并不限定于HA，还可以是flag、myc、his等其它具备标记功能的肽。一种假病毒包装系统的一步法包装方法，假病毒包装本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冠状病毒假病毒包装系统，其特征在于：包括改良型水泡性口炎病毒VSV、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞；所述冠状病毒为SARS、MERS或COVID-19病毒，所述刺突蛋白S的氨基酸序列为SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换结构基因的复制缺陷病毒，所述改良型水泡性口炎病毒VSV命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP，所述VSV的遗传物质中编码GP的基因被Fluc报告基因置换，所述EGFP的报告基因整合在Fluc与VSV聚合酶L基因之间，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP的基因序列为SEQ ID NO：3所示。/n

【技术特征摘要】
20200616 CN 20201054578561.一种冠状病毒假病毒包装系统，其特征在于：包括改良型水泡性口炎病毒VSV、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞；所述冠状病毒为SARS、MERS或COVID-19病毒，所述刺突蛋白S的氨基酸序列为SEQIDNO：4或SEQIDNO：5或SEQIDNO：6或SEQIDNO：7；所述改良型水泡性口炎病毒VSV定义为Fluc、EGFP双报告基因置换结构基因的复制缺陷病毒，所述改良型水泡性口炎病毒VSV命名为dVSVΔG-Fluc-EGFP，所述VSV的遗传物质中编码GP的基因被Fluc报告基因置换，所述EGFP的报告基因整合在Fluc与VSV聚合酶L基因之间，所述dVSVΔG-Fluc-EGFP的基因序列为SEQIDNO：3所示。


2.如权利要求1所述一种冠状病毒假病毒包装系统,其特征在于：所述装配细胞选自293、293T、293sus、HEK293、HEK293T、HEK293FT、BHK或Vero，所述装配细胞瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S，所述瞬时表达通过真核表达载体转染细胞实现，所述稳定表达通过慢病毒载体系统转导细胞实现，所述诱导表达通过四环素调控tet-on/off载体系统转导细胞实现。


3.一种假病毒包装系统的一步法包装方法，其特征在于：假病毒包装系统包括权利要求1或2中所述的冠状病毒假病毒包装系统，所述冠状病毒刺突蛋白S的表达为瞬时表达质粒或稳定表达质粒或稳定及诱导表达慢病毒载体介导，将dVSVΔG-Fluc-EGFP、表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞一步混合，一定时间后收集上清液得到冠状病毒假病毒。


4.如权利要求3所述一种假病毒包装系统的一步法包装方法，具体实施步骤如下：
(1)在瞬时或稳定或诱导表达VSV包膜蛋白GP的293T细胞中加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，24h后收集上清即可得到扩增后的VSV复制缺陷病毒，测定其滴度；
(2)将瞬时或稳定或诱导表达冠状病毒刺突蛋白S的装配细胞293T传代至60mmdish中，加入dVSVΔG-Fluc-EGFP，其中感染复数MOI＝0.1～5，置于32℃～37℃培养箱中培养，24h后收获假病毒上清液，再加入抗VSV的中和抗体处理2...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦晓峰，韦治明，龙丽梅，杨仁祥，李帆，
申请(专利权)人：睿丰康生物医药科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33