一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗，以水泡性口炎病毒VSV为载体，将VSV病毒基因组中的GP基因替换为冠状病毒的刺突蛋白S基因的截短体或病毒刺突蛋白S基因的胞外段与GP‑C段融合体ECD‑CA，刺突蛋白S基因截短体选自C端部分氨基酸缺失的基因，ECD‑CA为病毒刺突蛋白S基因的胞外段融合VSV病毒囊膜蛋白的跨膜和胞内段基因后的基因，本发明专利技术还涉及包膜替换型病毒载体疫苗的构建方法，首次将冠状病毒包膜完整的呈现给免疫细胞，此包膜替换型病毒具备良好的复制能力，可规模化快速生产，作为活疫苗接种最高程度地模拟冠状病毒侵染宿主细胞的生物学过程，快速激活机体的免疫系统，产生高强度和持久性的抗新冠病毒的中和抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用水泡性口炎病毒(vsv)构建的有效预防冠状病毒感染，尤其包含sars-cov-2冠状病毒包膜进行替换的病毒载体疫苗及其构建方法。
技术介绍
1、
2、冠状病毒(coronavirus)在病毒学分类上属于巢状病毒目(order nidovirals)、冠状病毒科(family coronavirade)、冠状病毒属(genus coronavirus)的成员，基因组为单股、正链的rna，基因组全长在26～32kb之间，是目前已知基因组最大的rna病毒。冠状病毒在自然界的感染普非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以及家禽类都易感。
3、冠状病毒按照核酸序列的系统发生分析，国际病毒学分类委员会(ictv，2012)在第九次报告中将冠状病毒属成员分成了α组、β组、γ组和δ组共四组。人冠状病毒主要分布于α组和β组。其中，hcov-229e和hcov-nl63位于α组，hcov-oc43和hcov-hku1位于β组中的2a亚组，mers-cov属于β组中的2c亚组，而最新席卷全球的sars-cov-2与sars属于β组中的2b亚组。
4、最新研究表明，该病毒的s刺突蛋白rbd段结合ace2的能力是sars的10倍之多，传播能力是目前已知主要的七种感染人的冠状病毒中最强的。sars-cov-2与sars冠状病毒的结构相似，体现在病毒表面的棘突蛋白s蛋白是病毒包膜上特异性的组织结构，在病毒的表面形成了大量的刺突蛋白，在病毒入侵靶细胞以及病毒与细胞识别时发挥着重要作用。
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p>5、新冠病毒可能像流感病毒一样，长期流行于人类社会，而包膜替换型病毒载体已经被证实是最具成本效益、最有效和最持久的疾病预防、控制措施，因而全民接种新冠包膜替换型病毒载体势在必行。6、研究表明，当前导致严重感染性疾病的病原体如人类免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒、严重急性呼吸综合征病毒(sars-cov)等均通过粘膜表面(生殖道、呼吸道、胃肠道)入侵和感染机体，由于机体不能诱导有效的粘膜免疫应答清除粘膜感染病原体，使病原体迅速扩散入血、进而侵犯全身，造成机体尤其是肺组织的损伤。
7、已知常规包膜替换型病毒载体如灭活、蛋白包膜替换型病毒载体、dna包膜替换型病毒载体、亚单位包膜替换型病毒载体等，经常规途径免疫(肌肉注射、皮下等)通常不能诱导特异性粘膜免疫应答。无论包膜替换型病毒载体的形式是什么，要诱导粘膜免疫应答通常需要将靶抗原从粘膜部位接种，才能有效被粘膜组织中的apc摄取并递呈，进一步激活粘膜免疫系统，诱导有效持久的粘膜免疫应答。
8、已知的包膜替换型病毒载体-水泡性口炎病毒(vsv)野毒株，在自然环境中可以感染多种动物和昆虫。家畜中自然感染vsv的有马、牛(羊)、猪，而人群中自然状态下不存在水泡性口炎病毒主动感染，因此也避免了预存抗体对病毒载体疫苗的药效影响(人体内预存在对腺病毒、痘病毒的中和抗体)，
9、因此将水泡性口炎病毒(vsv)作为包膜替换型病毒载体与其它病毒载体相比，具备天然的优势，可以完整的将冠状病毒的s蛋白展露在病毒表面，重组病毒无需通过感染宿主细胞，转录翻译外源病毒抗原蛋白，可直接在细胞外被免疫系统识别，并激活抗病毒的先天和后天特异性免疫应答，缩短抗病毒的反应时间，因此可以推论vsv作为病毒载体采用基因编辑技术通过将冠状病毒的包膜蛋白s展示在病毒表面，会显著增强机体的免疫应答的强度，诱导更强的后天性抗病毒反应(t细胞免疫应答和b细胞免疫应答)。
10、本专利技术利用vsv病毒载体的天然优势提出一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗及其构建方法，该类包膜替换型病毒载体疫苗对人患冠状病毒尤其是sars或者新冠病毒(sars-cov-2)有较好的预防或治疗作用。
技术实现思路
1、一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗，所述包膜替换型病毒载体疫苗是将弹状病毒基因组中的gp基因替换为冠状病毒的刺突蛋白s基因截短体或病毒刺突蛋白s基因的胞外段融合体ecd-ca，并利用反向遗传系统构建得到的用于预防冠状病毒的包膜替换型病毒载体疫苗，所述ecd-ca定义为病毒刺突蛋白s基因的胞外段ecd融合vsv病毒囊膜蛋白的跨膜和胞内段基因后的基因。
2、优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒vsv，所述vsv选自印第安那株，所述刺突蛋白s基因选自sars或sars-cov-2冠状病毒，所述刺突蛋白s基因截短体选自c端氨基酸缺失对应的基因，所述c端氨基酸缺失个数为18～72个。
3、优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述刺突蛋白s基因截短体选自c端缺失的基因，所述c端氨基酸缺失数目优选30个，且对应修饰后的刺突蛋白s对应的氨基酸序列为seq id no.1。
4、优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒vsv，所述vsv选自印第安那株，所述刺突蛋白s基因的胞外段融合体ecd-ca选自冠状病毒，所述ecd-ca包含冠状病毒刺突蛋白s基因的胞外段ecd，所述ecd的c端融合了vsv的囊膜蛋白的跨膜和胞内段基因ca。
5、优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述ecd-ca克隆到vsv基因组中m基因和l基因之间的编码序列中，所述ecd-ca氨基酸序列为seq id no.2,所述ecd-ca人源化密码子基因序列为seq id no.3。
6、优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述水泡性口炎病毒是其基质蛋白m的氨基酸发生突变后得到的病毒，所述基质蛋白m中氨基酸突变位点为第20位的亮氨酸、第51位甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸中的一个或多个且为非同义突变。所述第20位的亮氨酸、第51位甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸突变后对应的氨基酸可与下段中所述突变后氨基酸的种类对应相同或不同。
7、优选的，所述包膜替换型病毒载体疫苗，所述病毒载体是减毒水泡性口炎病毒，所述水泡性口炎病毒的基质蛋白m发生3位点氨基酸的突变，所述基质蛋白m的第20位由亮氨酸l突变为苯丙氨酸f、第51位由甲硫氨酸m突变为丙氨酸a、第110位由苯丙氨酸f突变为亮氨酸l，所述的3位点突变的基质蛋白m氨基酸序列为seq id no.4。
8、一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗的构建方法，包括如下步骤：
9、s1、利用合成生物学得到上述任一所述冠状病毒的s-cn截短体基因或上述任一所述ecd-ca包膜基因，基因片段用mlui和xhoi双酶切克隆至pvsv-3m质粒多克隆位点中，分别得到pcore-3m-s-cn或pcore-3m-ecd-ca质粒，其中所述冠状病毒的s-cn定位为冠状病毒刺突蛋白s基因在c端缺失n个氨基酸后对应的基因序列缩写，所述其中n＝18～72中的任一自然数；
10、s2、用表达t7-rna聚合酶的质粒pcaggs-t7瞬转ace2稳定表达的细胞；所述的ace2稳定表达的细胞优选自293t-hace本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗，其特征在于：所述包膜替换型病毒载体疫苗是将弹状病毒基因组中的GP基因替换为冠状病毒的刺突蛋白S基因截短体，利用反向遗传系统构建得到的用于预防冠状病毒感染的包膜替换型病毒载体疫苗，所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒VSV，所述VSV选自印第安那株，所述刺突蛋白S基因选自SARS或SARS-CoV-2冠状病毒，所述刺突蛋白S基因截短体选自C端氨基酸缺失对应的基因，所述C端氨基酸缺失个数为18～72个；所述刺突蛋白S基因截短体选自C端缺失的基因，所述C端氨基酸缺失数目优选30个，且对应修饰后的刺突蛋白S对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗，其特征在于：所述水泡性口炎病毒是其基质蛋白M的氨基酸发生突变后得到的病毒，所述基质蛋白M中氨基酸突变位点为第20位的亮氨酸、第51位甲硫氨酸、第110位的苯丙氨酸中的一个或多个且为非同义突变。
3.一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗的构建方法，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗的构建方法，其特征在于：步骤S4中所述RT-PCR中特异性扩增冠状病毒S-CN基因的荧光探针引物对为序列SEQID NO.5、SEQ ID NO.6。
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【技术特征摘要】
1.一种冠状病毒刺突蛋白包膜替换型载体疫苗，其特征在于：所述包膜替换型病毒载体疫苗是将弹状病毒基因组中的gp基因替换为冠状病毒的刺突蛋白s基因截短体，利用反向遗传系统构建得到的用于预防冠状病毒感染的包膜替换型病毒载体疫苗，所述弹状病毒载体选自水泡性口炎病毒vsv，所述vsv选自印第安那株，所述刺突蛋白s基因选自sars或sars-cov-2冠状病毒，所述刺突蛋白s基因截短体选自c端氨基酸缺失对应的基因，所述c端氨基酸缺失个数为18～72个；所述刺突蛋白s基因截短体选自c端缺失的基因，所述c端氨基酸缺失数目优选30个，且对应修饰后的刺突蛋白s对应的氨基酸序列为seq id ...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦晓峰，
申请(专利权)人：睿丰康生物医药科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：
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