一种多重荧光显色新型冠状病毒假病毒的制备方法及其用途技术

本公开涉及一种多重荧光显色新型冠状病毒假病毒的制备方法及其用途。具体来说，本公开涉及一种多重荧光显色新型冠状病毒假病毒组合物的制备方法，前述制备方法制备得到的多重荧光显色新型冠状病毒假病毒组合物及其用途。本公开可同时检测针对两种及两种以上不同新型冠状病毒株的中和抗体，更接近检测疫苗接种后的真实状况，其检测样本用量少，同时检测一个样本的两种及两种以上指标，可节约时间、样本，提高检测通量与分析效率，并且可自由搭配不同新型冠状病毒株的组合，精准检测针对不同变异病毒的中和抗体效价和活性滴度。本公开采用的检测方法操作步骤少、检测周期短、通量大、结果可比性强、精确度高、重复性好，可标准化、规模化实施。规模化实施。规模化实施。

【技术实现步骤摘要】
一种多重荧光显色新型冠状病毒假病毒的制备方法及其用途


[0001]本公开涉及基因工程
，具体为一种多重荧光显色新型冠状病毒假病毒的制备方法及利用其同时检测针对多种不同新型冠状病毒毒株中和抗体的方法。

技术介绍

[0002][0003]世界卫生组织根据变异株的传染性、疾病严重程度、再感染风险以及对诊断和疫苗性能的影响分成三个等级，即关注的变种(VOC)、感兴趣的变种(VOI)和监控中的变种(VUM)。
[0004]其中关注的变种(VOC)它具有以下几个特征：某些基因序列变化会影响病毒的特征，例如传染性、疾病严重程度、免疫逃逸、诊断或治疗逃逸；在多个国家流行，随着时间的推移病例数不断增加，全球公共卫生面临新的风险，已确定会导致严重的社区传播或集体感染等；具有传染性、毒性不断增强的趋势或公共卫生、社会措施、疫苗、治疗方法等手段有效性降低的趋势。截止2021年12月30日，目前只有5个符合关注变种的定义：Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron。
[0005]D614G变异是最早被识别并引起重视的变异株，病毒的传播性增强，目前D614G变异为基础的B.1谱系已经成为全球最广泛流行的变异株。随后高传染性、高致病性的Alpha(B.1.1.7)出现，使人们注意到N501Y突变改变S蛋白上RBD等结构从而改变临床特征。同样的变异也发生在Beta(B.1.351)和Gamma(P.1)，除D614G和N501Y外，这两种变异株同时还携带E484K和K417T/N突变，增加了病毒RBD与人体ACE2受体的亲和力和病毒的免疫逃逸能力。Delta(B.1.617.2)变异株同时具有L452R、T478K和P681R突变，因传染性增强、致病性强、免疫逃逸，是全球最主要流行变异株。
[0006]Omicron，这一新毒株于2021年11月9日在南非被首次确认，编号为B.1.1.529。新发现的奥密克戎毒株发生了很多变异，仅在其表面刺突蛋白上的变异就有32处，而新型冠状病毒正是通过刺突蛋白与人类细胞受体结合感染人体的。这种新毒株“似乎在所有已识别的抗原位点都有突变”，这或许会影响多数抗体对刺突蛋白的识别，提示可导致传染性增强，且对多种治疗性单克隆抗体(mAbs)，以及现有疫苗诱导的抗体产生抗性。世卫组织在最新报告中指出，新型冠状病毒变异病毒奥密克戎毒株在全球总体风险等级为“非常高”。
[0007]新型冠状病毒(2019
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nCov)包括有四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spikeprotein，S蛋白)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)、膜蛋白(Membraneprotein，M蛋白)、包膜蛋白(Envelopeprotein，E蛋白)。其中S蛋白为病毒感染宿主细胞时与细胞表面受体结合并完成感染过程的主要蛋白。S蛋白在SARS冠状病毒感染诱导的保护性体液免疫和细胞免疫中起着关键作用。因此，S蛋白被认为是SARS
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CoV疫苗和治疗开发最具吸引力的靶点。面对新型冠状病毒，灭活疫苗、重组亚单位疫苗、RNA疫苗、病毒载体疫苗、单克隆中和抗体、融合抑制剂等大部分是针对S蛋白设计的。
[0008]当前，全球防疫形势仍较为严峻，变异株的不断出现，带来很大的不确定性，无论
是上游病原学基础研究或疫苗、药物的开发，还是下游疫苗免疫效果的动态监测，都需要一种可靠的检测方法来提供技术支持。目前对于注射过新型冠状假病毒疫苗后的中和抗体评价主要有病毒中和法(VNT)、假病毒中和法(pVNT)。其中病毒中和法局限于必须在BSL
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3以上实验室进行，人员要求高、检测通量小的问题使其难以成为一种快捷高效的检测方法。
[0009]水疱性口炎病毒(VSV)是一种负链RNA病毒，其感染大部分哺乳动物细胞并在受感染细胞中表达高达总蛋白60％的病毒蛋白。在自然界中，VSV感染猪、牛和马，并在口和足附近导致水痘性疾病。虽然已有报道人感染VSV，但是VSV在人类中没有导致任何严重的症状。VSV编码5种蛋白，包括核壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、表面糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)。由VSV基质蛋白(M)阻断宿主细胞蛋白合成会诱导细胞死亡。
[0010]假病毒是一类利用病毒载体基因编辑与重组技术在复制缺陷型病毒表面表达、组装另一种病毒囊膜蛋白(Envelop protein)的嵌合病毒颗粒。假病毒因其特有生物安全性、稳定性，及可统一规范操作与应用等优点，已被广泛应用到疫苗研发，抗体中和活性效价检测、分析，模拟病毒侵染细胞研究、抗病毒药物筛选，以及检测试剂盒参考品、质控品研制等诸多方面。假病毒法中和抗体检测，在抗病毒抑制剂筛选、抗体血清学试验、疫苗免疫原性和抗体中和效力评价等对通量要求更高的临床和工业研究领域有更明显的优势。
[0011]目前假病毒法中和抗体检测主要通过化学发光检测仪、流式细胞仪、微孔板荧光细胞成像仪(如Tecan Spark Cyto、BioTek Cytation 5等)来实现。其中通过流式细胞仪检测，虽具有分辨率高，可识别多种不同荧光假病毒，但由于仪器和检测方法本身速度的限制，不能实现高通量测试。而基于化学发光仪检测中和抗体，尽管可进行高通量检测，但该方法操作步骤多，且一次只能检测一种新型冠状病毒假病毒的中和抗体，无法实现对多种新型冠状病毒毒株中和抗体的同时检测。因此流式细胞仪和化学发光仪对于大样本量的临床样本进行多种中和抗体检测的工作量十分巨大，无法开展在疫苗临床试验样本及血清流行病学调查等的大规模应用。

技术实现思路

[0012]专利技术要解决的问题
[0013]本公开提出一种多重荧光显色新型冠状病毒假病毒的制备方法及利用其检测同时多种不同新型冠状病毒毒株中和抗体的方法，通过荧光报告基因筛选、假病毒骨架质粒改造提高报告基因表达水平、表达不同荧光报告基因假病毒的组合及荧光报告基因信号读取方式优化，避免多重荧光信号之间的相互干扰等手段，并结合与多色微孔板荧光细胞成像仪的适配，解决同时特异性地检测多种针对不同新型冠状病毒株的中和抗体活性滴度或效价的瓶颈问题，使开展高通量、标准化、大规模新型冠状病毒中和抗体检测成为可能。
[0014]用于解决问题的方案
[0015]本公开记载了如下技术方案：
[0016](1)一种多重荧光显色新型冠状病毒假病毒组合物的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：
[0017](A)制备dVSVΔG假病毒组和重组质粒组，其中，所述dVSVΔG假病毒组包括分别表达不同荧光蛋白的dVSVΔG假病毒，所述重组质粒组包括分别表达不同新型冠状病毒株S蛋白的重组质粒；
[0018](B)将所述dVSVΔG假病毒组中表达任意一种荧光蛋白的dVSVΔG假病毒与所述重组质粒组中表达任意一种新型冠状病毒株S蛋白的重组质粒混合后，共转染宿主细胞，获得表达荧光蛋白且组装了新型冠状病毒株S蛋白的新型冠状病毒假病毒；
[0019](C)将通过步骤(B)制备本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重荧光显色新型冠状病毒假病毒组合物的制备方法，其中，所述方法包括如下步骤：(A)制备dVSVΔG假病毒组和重组质粒组，其中，所述dVSVΔG假病毒组包括分别表达不同荧光蛋白的dVSVΔG假病毒，所述重组质粒组包括分别表达不同新型冠状病毒株S蛋白的重组质粒；(B)将所述dVSVΔG假病毒组中表达任意一种荧光蛋白的dVSVΔG假病毒与所述重组质粒组中表达任意一种新型冠状病毒株S蛋白的重组质粒混合后，共转染宿主细胞，获得表达荧光蛋白且组装了新型冠状病毒株S蛋白的新型冠状病毒假病毒；(C)将通过步骤(B)制备得到的分别表达不同荧光蛋白且组装了新型冠状病毒株S蛋白的新型冠状病毒假病毒进行混合，以获得所述多重荧光显色新型冠状病毒假病毒组合物；其中，所述dVSVΔG假病毒的基因序列如SEQ ID NO：9所示。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述多重荧光显色新型冠状病毒假病毒组合物中的每种新型冠状病毒假病毒对应表达一种荧光蛋白与一种新型冠状病毒株S蛋白，且任意两种新型冠状病毒假病毒表达的荧光蛋白与新型冠状病毒株S蛋白均不同；优选地，所述多重荧光显色新型冠状病毒假病毒组合物中包括至少两种新型冠状病毒假病毒，所述至少两种新型冠状病毒假病毒对应表达至少两种荧光蛋白，且所述至少两种新型冠状病毒假病毒对应表达至少两种新型冠状病毒株S蛋白。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述制备表达不同荧光蛋白的dVSVΔG假病毒的方法包括以下步骤：(A
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1)表达不同荧光蛋白的dVSVΔG的载体构建将表达荧光蛋白的基因插入所述dVSVΔG假病毒的基因序列中，将所述基因序列转化入感受态细胞进行培养后，回收所述dVSVΔG假病毒的质粒，进而得到插入表达不同荧光蛋白的基因的所述dVSVΔG假病毒载体；通过上述步骤分别得到表达不同荧光蛋白的所述dVSVΔG假病毒载体；(A
‑
2)表达不同荧光蛋白的dVSVΔG假病毒的制备宿主细胞感染表达T7聚合酶的重组痘病毒后，分别稀释表达不同荧光蛋白的所述dVSVΔG假病毒载体和表达病毒结构蛋白的辅助质粒pP、pN、pL以及pVSVG质粒，将Lipofectamine LTX与辅助质粒pP、pN、pL，以及pVSVG质粒混合液混合，使得所述dVSVΔG假病毒包装，进而分泌到宿主细胞外以得到表达不同荧光蛋白的所述dVSVΔG假病毒；其中，所述pVSVG质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。4.根据权利要求1
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3任一项所述的制备方法，其中，所述表达不同新型冠状病毒株S蛋白的重组质粒的方法包括以下步骤：(A
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3)表达新型冠状病毒株S蛋白基因的合成根据不同新型冠状病毒株S蛋白的氨基酸序列，合成不同新型冠状病毒株S蛋白核苷酸序列，并且对于所述合成不同新型冠状病毒株S蛋白核苷酸序列的密码子进行了优化，使得所述核苷酸能够在宿主细胞内高效表达；可选的，所述新型冠状病毒株为野生型、Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron或其它变异病毒株及其亚型；(A
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4)表达新型冠状病毒株S蛋白质粒的构建及扩增
扩增C端部分缺失的新型冠状病毒株S蛋白基因目的片段，随后在前述片段的C端添加编码标签的基因以得到添加后的基因序列，将所述添加后的基...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦晓峰，潘龙玉，谭贤魁，陶柳性，陈正亮，
申请(专利权)人：睿丰康生物医药科技浙江有限公司，
类型：发明
国别省市：