联用积分法和初速度法测定酶活性的方法技术

一种联用积分法和初速度法测定酶活性的方法；对单一酶反应体系在低于米氏常数１０倍的预设底物浓度下连续监测反应３到１０分钟，当起始底物浓度高于预设底物浓度７０％且初速度仍在其线性范围内时测定经典初速度，当８０％记录时段内底物消耗比例高于积分法所需下限时用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定最大反应速度，再将最大反应速度计算成预设底物浓度９３％时的初速度，并使经典初速度和计算初速度对酶量响应曲线斜率相同；当８０％记录时段内偶联酶反应体系底物消耗比例高于积分法所需下限时用对应的数值积分速度方程，迭代拟合酶反应曲线确定初速度，否则直接测定经典初速度；优化监测反应的总时间是两种方法联用的保障。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用于临床检验、卫生检验等领域测定酶活性的方法，其特征是用经典初速度法测定低活性酶反应体系的初速度，用积分法测定高活性反应体系的酶反应最大速度，通过换算成优化底物浓度下的初速度，使积分法和初速度法的响应曲线变成同一条直线，从而用较低的底物浓度获得更高的线性响应上限和更宽的线性响应范围，并保障分析效率。
技术介绍
测定酶活性是临床检验和环境卫生检验等领域的常规工作。目前测定酶活性常用初速度法，但需用尽可能高的底物浓度以获得较高的线性响应上限和较宽的线性响应范围。当底物溶解度有限，或高浓度底物有抑制或激活作用，或底物成本限制时，经典初速度法的线性范围较窄。用积分速度方程分析酶反应过程可测定酶活性，此即积分法。经典积分法为降低计算工作量将积分速度方程转换成线性形式，但所用方程的自变量含随机误差，且易受反应起点误差等的影响，可靠性太低而无法应用。随着常规计算能力的显著提高，用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合酶反应动力学过程曲线成为新的酶反应动力学过程分析方法，此即新积分法，其所用底物浓度更低而线性响应上限更高。积分法要求被分析数据中底物消耗比例越高越好，其初始底物浓度越低则对底物消耗最低比例要求也越低，但其下限一般在40％左右。因此，当待测样品活性低时，就需很长的测定时间记录酶反应的动力学过程，使得其分析效率无法得到保证。另外，现有偶联酶反应体系都要求偶联工具酶活性尽可能高，否则线性上限很低，而用积分法分析偶联酶反应动力学过程至今没有成为常规方法。 经典初速度法测定酶活性的最大优势是分析效率高，而积分法的最大优势是在更低的底物浓度下线性响应上限却更高。理论上预期，将积分法与初速度法联用有望在较低底物浓度下既提高测定效率，又显著提高线性响应上限，从而有效拓宽线性响应范围。这种策略已尝试过(见Biochem J，1975，149305-312；Biochem J，1982；203117-123；Biochem J，1985；22855-60)，但这些尝试中，当被分析的酶反应曲线中底物消耗比例超过50％以后反而偏差越来越大，尤其对反应起点误差和初始底物浓度误差也很敏感，不能常规应用。 此前尝试的联用方法中所用积分速度方程的自变量都不是反应时间，都含有随机误差和系统误差，这可能是其可靠性低的原因。但如用以反应时间为自变量的积分速度方程分析酶反应过程，有望使积分法测定酶活性对反应起点误差不明感，在底物消耗比例较高时可靠性更高，从而可同经典初速度法联用测定酶活性而拓宽线性响应范围，并保障分析效率。
技术实现思路
本专利技术目的是联用积分法和经典初速度法测定酶活性，从而用中等底物浓度获得更高的线性响应上限和更宽的线性响应范围，并保障分析效率。 本专利技术的技术方案是用中等底物浓度，在酶活性足够高时，对偶联酶反应用积分法测定初速度、对单一酶反应用积分法测定最大反应速度再换算成优化初始底物浓度下的初速度；在酶活性较低时，直接用经典初速度法测定酶活性。此联用方法的关键是两种方法测定酶活性对酶量线性响应斜率相同，对两种方法都能测定的酶样品给出相同的酶活性，其特征在于 (一)、取一定量所需缓冲液加入试管内，再加入一定量底物溶液；单一酶反应体系的初始底物浓度在待测酶米氏常数0.10到10倍之间；对偶联一个工具酶的偶联酶反应体系，待测酶的底物浓度设置与用经典初速度法完全相同(即待测酶的底物浓度高于对应米氏常数的10倍，偶联工具酶的指示底物浓度为检测仪器线性响应范围的上限或尽可能高)； (二)、将上述溶液混匀后在选定温度(25～37℃)下恒温5～10分钟； (三)、在上述溶液中加入待测酶液，立即混匀，迅速将反应混合物转移到比色杯(或其它可连续监测酶反应过程的检测器样品室)； (四)、延迟15秒，以1～30秒间隔记录对待测底物或产物线性响应的检测信号(如光吸收)，共记录3分钟以上(10分钟以内)获得底物或产物随时间变化的反应曲线(偶联酶反应体系用1秒间隔记录)，监测反应的时间不超过10分钟； (五)、数据过滤，去掉相邻数据点中对应的检测信号变化小于仪器检测噪声2倍的数据(即去掉底物或产物浓度无显著变化的数据)； (六)、将单一酶单底物反应微分速度方程积分成以反应时间为自变量的形式，将偶联一个工具酶的微分速度方程数值积分成以反应时间为自变量的形式(数值积分步长0.1秒)，如存在产物抑制则在此积分速度方程中需包含产物抑制的效应。 如监测反应过程中逐渐增加的瞬时吸收Ai，被测物质摩尔消光系数为ε，反应体系最大吸收为Am，本底为Ab，酶对底物的米氏常数为Km；当用硫代丁酰胆碱为底物(加巯基显色剂)测定血清丁酰胆碱酯酶(单一酶)反应的产物吸收增加过程(来自硫代丁酰胆碱巯基水解生成的反应产物吸收的增加过程)，可用如下的积分速度方程非线性拟合 -ln(Am-Ai)+Ai/(ε×Km)＝a+b×t[1] 当用丙酮酸和NADH为底物测定乳酸脱氢酶反应的底物消耗(NADH吸收下降)过程，可用如下积分速度方程非线性拟合反应曲线 -ln(Ai-Ab)-Ai/(ε×Km)＝a+b×t[2] 当用γ-谷氨酰基对硝基苯胺和双甘肽为底物测定存在产物竞争性抑制的γ-谷氨酰基转移酶(GGT)活性，设产物γ-谷氨酰双甘肽的抑制常数同另一个产物对硝基苯胺的摩尔消光系数乘积为Aki，用包含产物抑制的如下积分速度方程非线性拟合反应曲线 -Km×(Aki+Am-Ab)/Aki×ln(Am-Ai)+(1/ε-Km/Aki)×(Am-Ai)＝a+b×t [3] 对上述单一酶反应体系，数据转换后用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合反应曲线，所得对应的速度(即方程[3]中系数b)为最大反应速度。此方程不同于此前报道的GGT反应动力学机制模型(Biochem J，1976，157609-617)，适用于分析底物浓度低于酶Km的反应曲线。当所用底物浓度高于酶Km时，用文献报道的模型与用此模型所得结果相近。 当用丙氨酸加α-酮戊二酸为谷丙转氨酶(ALT)底物，以NADH为指示底物，偶联乳酸脱氢酶(LDH)，用数值积分速度方程迭代拟合反应曲线确定ALT活性(VALT)，所用方程组如下 其中，NADH1表示前一记录点对应的NADH浓度，NADH2表示据当前的丙酮酸(PYR)浓度、NADH浓度和LDH活性递归推算的下一记录点的NADH浓度，PYR1表示前一记录点对应的PYR浓度，PYR2表示按照当前设定的参数和反应速度推算下一点的PYR浓度；VNADH表示NADH浓度下降速度，KmNADH表示LDH对NADH的米氏常数，Kmpyr表示LDH对PYR的米氏常数，Kmab，表示两个米氏常数的交叉项；dt为数值积分所用步长；当用猪心LDH为工具酶时，上述参数定义和设置详见J Biol Chem，1962；237(5)1668-1675。 (七)、当所设定记录的单一酶反应过程数据对应的最高底物浓度高于酶作用前的70％，且分析底物消耗10％范围内数据的平均速度仍然在经典初速度法的线性范围内，则用经典初速度法确定底物消耗低于10％范围内的平均速度为经典初速度表示酶活性； (八)、当反应进行到预设记录总时间8本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种联用积分法和初速度法测定酶活性，从而用中等底物浓度和较高效率获得更宽线性响应范围的方法，其特征在于按如下步骤进行：　　　　（一）、取一定量所需缓冲液加入试管内，再加入一定量底物溶液，单一酶的单底物反应体系初始底物浓度在待测酶米氏常数０．１０到１０倍之间，偶联一个工具酶的反应体系所需各种底物浓度及工具酶活性与用初速度法测定偶联酶反应体系酶活性时完全相同（即待测酶的底物浓度高于其米氏常数的１０倍，偶联工具酶活性尽可能高，指示底物浓度为检测仪器线性响应范围的上限）；　　　　（二）、将上述溶液混匀后在选定温度（２５～３７℃）下恒温５～１０分钟；　　　　（三）、在上述溶液中加入待测酶液样品，立即混匀，迅速将反应混合物转移到比色杯（或其它可连续监测酶反应过程的分析仪器的样品室）；　　　　（四）、延迟２０秒，以１～６０秒间隔监测与底物或产物成比例的检测信号（如光吸收），共记录３分钟到１０分钟（偶联酶反应体系记录间隔应尽量短）；　　　　（五）、数据过滤，去掉相邻数据点中检测信号变化小于仪器检测噪声２倍的数据（即去掉底物或产物浓度无显著变化的数据），换算成底物或产物浓度随时间变化的反应曲线；　　　　（六）、将单一酶单底物反应微分速度方程积分成以反应时间为自变量的积分速度方程，将偶联一个工具酶的微分速度方程数值积分成以反应时间为自变量的积分速度方程；如有底物或产物抑制则在积分速度方程中包含其抑制效应；　　　　（七）、在设定条件下，如所记录反应曲线中对应的最高底物浓度高于酶作用前的７０％，且分析底物消耗１０％范围内数据的平均速度（即经典初速度）仍低于初速度法的线性上限时，则用初速度法确定其经典初速度表示酶活性；　　　　（八）、当反应进行到记录总时间８０％时（记录总时间为６分钟则此时间约４．５分钟），如单一酶单底物体系的底物消耗比例高于积分法所要求下限（一般约４０％，初始底物浓度太低或太高时此底物消耗比例的下限更高），则以最大反应速度及初始底物浓度（或相当的对应物理量）为参数，其余动力学参数固定为已知常数，用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合反应曲线确定对应的最大反应速度，此即用积分法测定单一酶体系的酶活性；当偶联一个工具酶反应体系指示底物消耗比例高于积分法所要求的下限（一般为７５％，指示底物的浓度不同、工具酶的动力学参数不同时此底物消耗比例要求的下限也不同）时，则用待测酶反应初速度和偶联酶指示底物浓度为参数，用对应的数值...

【技术特征摘要】
1.一种联用积分法和初速度法测定酶活性，从而用中等底物浓度和较高效率获得更宽线性响应范围的方法，其特征在于按如下步骤进行(一)、取一定量所需缓冲液加入试管内，再加入一定量底物溶液，单一酶的单底物反应体系初始底物浓度在待测酶米氏常数0.10到10倍之间，偶联一个工具酶的反应体系所需各种底物浓度及工具酶活性与用初速度法测定偶联酶反应体系酶活性时完全相同(即待测酶的底物浓度高于其米氏常数的10倍，偶联工具酶活性尽可能高，指示底物浓度为检测仪器线性响应范围的上限)；(二)、将上述溶液混匀后在选定温度(25～37℃)下恒温5～10分钟；(三)、在上述溶液中加入待测酶液样品，立即混匀，迅速将反应混合物转移到比色杯(或其它可连续监测酶反应过程的分析仪器的样品室)；(四)、延迟20秒，以1～60秒间隔监测与底物或产物成比例的检测信号(如光吸收)，共记录3分钟到10分钟(偶联酶反应体系记录间隔应尽量短)；(五)、数据过滤，去掉相邻数据点中检测信号变化小于仪器检测噪声2倍的数据(即去掉底物或产物浓度无显著变化的数据)，换算成底物或产物浓度随时间变化的反应曲线；(六)、将单一酶单底物反应微分速度方程积分成以反应时间为自变量的积分速度方程，将偶联一个工具酶的微分速度方程数值积分成以反应时间为自变量的积分速度方程；如有底物或产物抑制则在积分速度方程中包含其抑制效应；(七)、在设定条件下，如所记录反应曲线中对应的最高底物浓度高于酶作用前的70％，且分析底物消耗10％范围内数据的平均速度(即经典初速度)仍低于初速度法的线性上限时，则用初速度法确定其经典初速度表示酶活性；(八)、当反应进行到记录总时间80％时(记录总时间为6分钟则此时间约4.5分钟)，如单一酶单底物体系的底物消耗比例高于积分法所要求下限(一般约40％，初始底物浓度太低或太高时此底物消耗比例的下限更高)，则以最大反应速度及初始底物浓度(或相当的对应物理量)为参数，其余动力学参数固定为已知常数，用以反应时间为自变量的积分速度方程非线性拟合反应曲线确定对应的最大反应速度，此即用积分法测定单一酶体系的酶活性；当偶联一个工具酶反应体系指示底物消耗比例高于积分法所要求的下限(一般为75％，指示底物的浓度不同、工具酶的动力学参数不同时此底物消耗比例要求的下限也不同)时，则用待测酶反应初速度和偶联酶指示底物浓度为参数，用对应的数值积分速度方程(数值积分步长0.1秒，尽可能短)迭代拟合酶反应曲线，达到最好拟合的待测酶反应初速度为待测参数，此即用积分法测定偶联酶反应体系的酶活性；(九)、对单一酶反应体系，用其微分速度方程和固定为常数的其它动力学参数，将积分法所得最大反应速度换算成在所用反应体系初始底物浓度93％(随初始底物浓度变化，但波动在4％以内)底物浓度下的初速度，此即用积分法所得单一酶反应体系的计算初速度；优化最大反应速度换算成计算初速度所用的底物浓度以同时满足下列两个要求(1)计算初速度对酶量的响应曲线斜率同低酶活性范围内经典初速度对酶量的响应曲线斜率无统计差异，(2)对初速度法能可靠测定而此积分法也能可靠测定的酶活性交叉区域内的样品，用积分法所得的计算初速度同初速度法所得的经典初速度也无统计差异。2.据权利要求1所述联用积分法与初速度法测定酶活性的方法，其特征在于如步骤(七)到步骤(九)所述，当单一酶反应体系所记录的反应起始阶段的底物浓度仍高于酶作用前的70％且对应的经典初速度仍在初速度法的线性范围内，则用初速度法测定经典初速度表示酶活性；当所设定记录时间80％内底物消耗比例已高于所用实验条件下积分法测定酶活性所要求的底物消耗比例下限，就用以反应时间为自变量的积分速度方程，以初始底物浓度(或最大产物浓度等相当的物理量)、最大反应速度为待测参数，其余所需动力学或热力学参数为固定常数，非线性拟合酶反应过程确定最大反应速度，再按照步骤(九)所述换成成计算初速度表示酶活性...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖飞，赵运胜，赵利娜，陆巍，杨晓兰，廖红，于明安，桑宇，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]