一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法及应用，本发明专利技术采用超滤器透析与用透析袋透析相比，透析效率显著提高，透析时间缩短为原来的1/5，透析外液用量减少至原来的1/20，透析后的rPA溶液澄清透明，盐酸胍、还原剂DTT等小分子物质去除更为彻底；超滤器透析后所得rPA溶液经后续步骤生产所得rPA蛋白整体收率提高了20％。本发明专利技术对于规模化、工业化包涵体尤其是含二硫键较多的包涵体的复性纯化提供了一种简捷高效的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法及应用
本专利技术涉及包涵体复性纯化
，具体地，涉及一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法及应用。
技术介绍
重组人组织型纤溶酶激酶衍生物(rPA)适用于成人由于冠状动脉梗塞引起的进行心肌梗塞的溶栓疗法，能改善心肌梗塞后的心室功能。目前rPA因其具有溶栓作用强、起效迅速、维持时间长、再通率高、不良反应小、使用方便等特点已经成为第三代溶栓药物的代表之一。rPA是天然组织型纤溶酶原激酶(tPA)的缺失突变体，只保留了tPA丝氨酸蛋白酶区(与酶的活性有关)和Kringle2区(与纤维蛋白定向性质有关)。因不含糖基化位点，可以利用基因重组技术在大肠杆菌中表达生产。rPA含有18个半胱氨酸，有9对分子内二硫键，在大肠杆菌中表达时基本全部以包涵体形式存在。由于外源蛋白质在大肠杆菌中高效表达时形成的包涵体具有不可溶、无生物活性的特点，将包涵体恢复为有活性的目的蛋白，必须对包涵体进行增溶、复性等操作。一般情况下，包涵体复性的活性回收率不高，仅为5％～20％，尤其在大规模工业化复性时复性率更低，从而导致许多蛋白药物成本升高。其中对包涵体增溶液的透析是复性前不可缺少而又影响复性回收率较大的因素。包涵体蛋白的增溶一般需要加入变性剂盐酸胍或尿素等，复性之前需要去除盐酸胍，常规做法是利用透析袋对增溶液透析，如专利CN102367264B提供了一种纯化包涵体蛋白质的方法，但是该方法溶液处理量少，透析时间长，工作量大，浪费物料，效率低，效果相对本专利技术所述方法较差；且在透析时，rPA蛋白在两种变性剂换相过程中会出现蛋白折叠而导致目的蛋白沉淀析出的现象。因此，找到一种可有效去除盐酸胍，提升透析效率，减少rPA透析时的析出现象，从而提高rPA蛋白的回收率的方法，对于规模化、工业化rPA包涵体的复性纯化具有相当的必要性。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种利用超滤器进行重组人组织型纤溶酶激酶衍生物(rPA)包涵体增溶液高效透析换相的方法，与用透析袋透析相比，该方法透析效率显著提高，透析时间缩短为原来的1/5，透析外液用量减少至原来的1/20，透析后的rPA溶液澄清透明，盐酸胍、还原剂DTT等小分子物质去除更为彻底。超滤器透析后所得rPA溶液经后续步骤生产所得rPA蛋白整体收率提高了20％。对于规模化、工业化制药生产蛋白质的透析，尤其针对二硫键较多的包涵体増溶透析，提供了一种简捷高效的方法。本专利技术的首要目的是提供一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法。本专利技术的另一目的是提供所述方法在对rPA包涵体的复性纯化中的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：本专利技术提供了一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法，包含如下步骤：S1.增溶液的配制：配制pH为7～9，包含5～7mol/L盐酸胍，45～55mmol/LTris，0.8～1.2mmol/LEDTA·Na2的水溶液作为增溶液；S2.增溶透析内液的制备：将rPA包涵体与步骤S1增溶液按照1～2kg：20～40L的比例混合；再向其中加入二硫苏糖醇至浓度为35～45mmol/L，调整pH为7～9，混合均匀，再调整pH为2.5～3.5，即得到增溶透析内液；S3.透析外液的配制：配制pH为2.5～3.5，包含7～10mol/L尿素，1mmol/LEDTA·Na2的水溶液作为透析外液；S4.超滤器透析：取增溶透析内液先浓缩至原体积的一半，加入等体积的透析外液混合后再次浓缩至原体积的一半，得到透析内液；然后使用超滤器浓缩透析内液，连续加入透析外液进行换相，保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h，透析换相时间为2～4小时。本专利技术通过控制包涵体增溶液和透析外液的制备，以及采用超滤器透析，可显著降低rPA透析时的析出现象，显著提升rPA透析过程的澄清度，既可降低对超滤器造成堵塞，又可提升rPA的回收率。对于规模化、工业化包涵体尤其是含二硫键较多的包涵体的复性纯化提供了一种简捷高效的方法。优选地，步骤S1所述增溶液的pH为8.6，盐酸胍为6mol/L，Tris为50mmol/L，EDTA·Na2为1mmol/L。优选地，步骤S2中增溶透析内液的制备为：将rPA包涵体与步骤S1增溶液按照1.5kg：30L的比例混合；再向其中加入二硫苏糖醇至浓度为40mmol/L，调整pH为8.6，混合均匀，再调整pH为3，即得到增溶透析内液。优选地，步骤S2所述混合均匀为搅拌2h混匀。优选地，步骤S3所述透析外液的pH为3。优选地，步骤S3所述透析外液中尿素的浓度为8～10mol/L。最优选地，步骤S3所述透析外液中尿素的浓度为8mol/L。优选地，步骤S4所述超滤器为使用截留量为10kD的膜包进行透析换相，可有效截留rPA蛋白，盐酸胍、还原剂DTT等小分子透过膜后废弃。优选地步骤S4所述透析换相时间为3.25～4小时。最优选为4小时。本专利技术还请求保护上述方法在对rPA包涵体的复性纯化中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术使用超滤器进行包涵体增溶液换相的新型方法与用透析袋透析相比，该方法透析效率显著提高，透析时间缩短为原来的1/5，透析外液用量减少至原来的1/20，透析后的rPA溶液澄清透明，盐酸胍、还原剂DTT等小分子物质去除更为彻底。超滤器透析后所得rPA溶液经后续步骤生产所得rPA蛋白整体收率提高了20％。对于规模化、工业化制药生产蛋白质的透析，尤其针对二硫键较多的包涵体増溶透析，提供了一种简捷高效的方法。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1溶液的配制(1)增溶透析内液的制备：配制增溶液(6mol/L盐酸胍，50mmol/LTris，1mmol/LEDTA·Na2，pH为8.6)；取rPA包涵体加入到增溶液中，包涵体与增溶液按照1.5kg：30L的比例混合，再向其中加入二硫苏糖醇(DTT)至浓度为40mmol/L，用NaOH溶液微调pH为8.6，搅拌2h后，再用稀盐酸调pH为3.0，得到增溶透析内液，备用。(2)配制透析外液：透析外液1(4mol/L尿素，1mmol/LEDTA·Na2，pH3.0)；透析外液2(5mol/L尿素，1mmol/LEDTA·Na2，pH3.0)；透析外液3(6mol/L尿素，1mmol/LEDTA·Na2，pH3.0)；透析外液4(7mol/L尿素，1mmol/LEDTA·Na2，pH3.0)；透析外液5(8mol/L尿素，1mmol/LEDTA·Na2，pH3.0)；透析外液6(9mol/L尿素，1mmol/LEDTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法，其特征在于，包含如下步骤：/nS1.增溶液的配制：配制pH为7～9，包含5～7mol/L盐酸胍，45～55mmol/L Tris，0.8～1.2mmol/L EDTA·Na

【技术特征摘要】
1.一种重组人组织型纤溶酶激酶衍生物包涵体增溶液的透析方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.增溶液的配制：配制pH为7～9，包含5～7mol/L盐酸胍，45～55mmol/LTris，0.8～1.2mmol/LEDTA·Na2的水溶液作为增溶液；
S2.增溶透析内液的制备：将rPA包涵体与步骤S1增溶液按照1～2kg：20～40L的比例混合；再向其中加入二硫苏糖醇至浓度为35～45mmol/L，调整pH为7～9，混合均匀，再调整pH为2.5～3.5，即得到增溶透析内液；
S3.透析外液的配制：配制pH为2.5～3.5，包含7～10mol/L尿素，1mmol/LEDTA·Na2的水溶液作为透析外液；
S4.超滤器透析：取增溶透析内液先浓缩至原体积的一半，加入等体积的透析外液混合后再次浓缩至原体积的一半，得到透析内液；然后使用超滤器浓缩透析内液，连续加入透析外液进行换相，保持超滤器透过速度和透析外液加入速度均为2.5L/h，透析换相时间为2～4小时。


2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S1所述增溶液的pH为8.6，盐酸胍为6mol/L，Tris为50mmol/L，EDTA·...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦绪才，解福生，郝向慧，庞甲佩，姜栋，吴化斌，徐兴贵，孙云磊，宋义健，田立帅，付蓝天，
申请(专利权)人：华润昂德生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37