一种蛋白复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种重组蛋白、含该重组蛋白的蛋白复合物和应用。本发明专利技术重组蛋白由人源白介素1受体拮抗剂蛋白与含有VPGKG重复单元的蛋白组成，可用于包括类风湿性关节炎、急性痛风性关节炎及其它存在白介素1(interleukin，IL‑1)增多的风湿免疫病、遗传性疾病及肿瘤的辅助治疗，疗效显著。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白复合物及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种蛋白复合物及其制备方法和应用。
技术介绍
类风湿性关节炎是一种人类免疫性疾病，目前对于该疾病病因的探索还处于初级阶段。除患者本身遗传因素，感染、免疫系统异常、环境因素(如接触二氧化硅、感染因子、体内维生素D缺乏)、不良生活习惯(如吸烟、肥胖)、体内微生物群改变等多中因素均会导致该疾病风险升高。患有类风湿性关节炎的患者，其罹患高血压、糖尿病、高脂血症和肥胖症的发病率分别为18.6％、6.0％、9.9％和4.4％，这些继发的心血管疾病是导致患者过早死亡的常见原因。由于在发病早期病情对患者影响不大，且反复给药患者依从性差，多数患者易主动暂停或终止治疗过程，使得病情进一步加深。在发病中后期，患者四肢关节、肘、肩、颈椎、髋、膝等关节处出现明显的关节炎症，关节腔积液挤入关节后侧形成腘窝囊肿、导致肢端无力甚至难以回复到正常位置，最终出现关节、肢端畸形。晚期类风湿性关节炎症状无法通过药物治疗改善，只能通过关节置换外科手术疗法调整患者关节功能，改善生活质量；但此时接受治疗的人群多集中于中老年群体，手术风险高，治疗花销高昂。由于类风湿性关节炎发病机制尚不明确，诱因复杂。所以临床用一线药物主要通过消炎、止痛、解热为主，从而缓解患者的不适感，主要为非甾类抗炎药和糖皮质激素类。此类药物价格低廉，长期使用会导致肝肾、胃肠道损伤等副作用，且反复用药疗效会降低。另外，疾病修饰类抗类风湿药可明显缓解关节炎症和急性，但起效缓慢，其对患者带来的代谢压力和心理负担相对较高。r>痛风的发病症状与类风湿类似。由于灵长类动物存在嘌呤代谢酶缺陷，随着高嘌呤食物摄入增多和排泄异常，体内尿酸增多并在关节处聚集形成单钠尿酸盐晶体(痛风石)，从而引发炎症。痛风发病过程可分为无症状高尿酸血症期、急性期、间歇期、慢性期。患者从无症状的高尿酸血症转入急性期后，开始出现疲乏、全身不适和关节刺痛等反应；痛风发作时会导致患者因关节剧烈疼痛从深夜惊醒，在12小时后发展为撕裂样、刀割样或咬噬样痛感，难以忍受。发作关节及其周围组织会出现红、肿、热、痛和功能受限。在间歇期，痛风发作后数天或数周可以自行缓解，一般无明显后遗症；但在数月或数年复发后，发病频率逐渐升高、持续时间持续延长，受累关节范围扩大至指、腕、肘甚至、髋、骶髂、胸锁或脊柱关节。痛风发作10年左右进入慢性痛风石病变期。此时患者皮下、关节滑膜、软骨、骨质及关节周围软组织处沉积有大量单钠尿酸盐晶体，在关节活动时，这些尿酸盐结晶摩擦关节滑膜、软骨等组织，导致关节处组织磨损、发炎、关节骨质出现破坏，患者关节处持续肿痛、甚至出现畸形和功能障碍，严重影响患者的生存活动和生活质量。当前痛风治疗一线用药包括别嘌醇类和非布司他，以及促尿酸排泄药物苯溴马隆；二线用药包括秋水仙碱等。这些药物在部分人群中无明显治疗效果，且容易复发、存在严重肝肾毒性。类风湿性关节炎和痛风发作过程中，关节处的白介素1(IL-1)含量明显升高，并进一步引发局部的炎症反应，导致组织肿胀、炎症细胞浸润以及软骨损伤。通过白介素1受体拮抗剂(IL-1RA)抑制IL-1受体与IL-1的结合，可快速抑制IL-1导致的炎症反应，有效减缓病情发展。目前，人源白介素1受体拮抗剂(阿那白滞素)已成功应用于类风湿性关节炎和急性痛风性关节炎的治疗中，但由于其在体内半衰期短，患者需要反复给药达到治疗效果，而且价格昂贵。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种重组蛋白及其制备方法和应用，该复合物包括人源IL-1RA蛋白和含VPGKG重复序列的蛋白，可用于包括类风湿性关节炎、急性痛风性关节炎及其它以白介素1(interleukin-1，IL-1)异常增高为显著特点的风湿免疫病、遗传性疾病及肿瘤的辅助治疗，疗效显著。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术第一方面提供了一种重组蛋白，包括人源IL-1RA蛋白和含VPGKG重复序列的蛋白。在一些实施方案中，所述人源IL-RA序列来自人源IL-1RA蛋白剪接体1(SEQIDNO1)、人源IL-1RA蛋白剪接体2(SEQIDNO2)、人源IL-1RA蛋白剪接体3(SEQIDNO3)或人源IL-1RA蛋白剪接体4(SEQIDNO4)。在一些优选的实施方案中，所述人源IL-RA序列来自人源IL-1RA蛋白剪接体3。具体地，所述人源IL-1RA蛋白具有如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示的任意一种氨基酸序列；或具有与SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示序列功能相同或相似的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述含VPGKG重复序列的蛋白由n个重复单元(VPGKG)和m个重复单元(VPGXG)组成，其中，X为任意一种天然氨基酸，m、n为大于零的整数；优选地，m为0～20之间的整数，n为1～150之间的整数；重复单元(VPGKG)和(VPGXG)随意组合。在一些实施方案中，含有(VPGKG)序列的重复蛋白单元具有(VPGXG)m(VPGKG)n特征的重复单元结构。在一些实施方案中，X为缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一些优选的实施方案中，重复蛋白单元具有[(VPGAG)2(VPGKG)8]9特征结构；在一些优选的实施方案中，重复蛋白单元具有[(VPGGG)1(VPGKG)3(VPGAG)2(VPGKG)5(VPGVG)2(VPGKG)9]5特征结构；在一些优选的实施方案中，重复蛋白单元具有[VPGVG(VPGKG)9]6特征结构；在另一些优选的实施方案中，重复蛋白单元具有[VPGVG(VPGKG)9]8特征结构。在一些实施方案中，IL-1RA蛋白序列和含有(VPGKG)序列的重复蛋白单元序列间通过肽键或者连接肽连接。在一些优选的实施方案中，IL-1RA序列和含有(VPGKG)序列的重复蛋白单元序列由连接肽连接。所述连接肽为多个连续的任意氨基酸。一些实施方案种，所述连接肽具有重组蛋白全长的10％以下的氨基酸个数。一些优选实施方案中，所述多个为13个、14个或18个。一些具体实施例中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5～SEQIDNO.7中任一项所示。在一些实施方案中，本专利技术重组蛋白还包含该蛋白的保守性修饰变体。所述保守性修饰变体包括本专利技术重组蛋白中的10％的氨基酸，优选5％的氨基酸，更优选2％的氨基酸，最优选1个氨基酸被其功能上相似的保守性氨基酸全部、或者部分置换所得的变体。所述保守性置换是本领域公知的，包括以下6组氨基酸：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；精氨酸(R)、赖氨酸(K)；异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。由此获得的重组蛋白变体的总净电荷和其分子上电荷分布与置换前基本上保持相同。在一些实施方案中，本专利技术重组蛋白具有SEQIDNO.13～SEQIDNO.72所示的任意一种氨基酸序列，或具有与SEQIDNO.13～SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组蛋白，包括人源IL-1RA蛋白和含(VPGKG)重复序列的蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.重组蛋白，包括人源IL-1RA蛋白和含(VPGKG)重复序列的蛋白。


2.根据权利要求1所述的重组蛋白其特征在于，所述人源IL-1RA蛋白和含VPGKG重复序列的蛋白通过肽键直接相连或通过连接肽相连。


3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述人源IL-1RA蛋白具有如SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示的任意一种氨基酸序列；或具有与SEQIDNO.1～SEQIDNO.4所示序列功能相同或相似的氨基酸序列。


4.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述含(VPGKG)重复序列的蛋白由n个重复单元(VPGKG)和m个重复单元(VPGXG)组成；其中，X为任意一种天然氨基酸，m、n为大于零的整数；优选地，m为0～20之间的整数，n为1～150之间的整数；重复单元(VPGKG)和(VPGXG)随意组合；优选地，X为缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。


5.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述连接肽由多个连续的任意氨基酸氨基组成。


6.根据权利要求1～5任一项所述的重组蛋白，其特征在于，具有SEQIDNO.13～SEQIDNO.72所示的任意一种氨基酸序列，或具有与SEQIDNO.13～SEQIDNO.72所示的任一序列至少80％同一性的氨基酸序列，或具有与SEQIDNO.13～SEQIDNO.72所示的任一序列功能相同或相似的氨基酸序列。


7.编码权利要求1～6任一项所述重组蛋白的核酸，其特征在于，具有：
SEQIDNO.73～SEQIDNO.132所示的任意一种核苷酸序列；或
与SEQIDNO.73～SEQIDNO.132所示序列至少有80％同一性的核苷酸序列；或
与SEQIDNO.73～SEQIDNO.132所示序列编码相同蛋白，但因遗传密码的简并性而与SEQIDNO.73～SEQIDNO.132所示序列不同的核苷酸序列。


8.权利要求1～6任一项所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于：
(1)构建权利要求7所述核酸的表达载体；
(2)将权利要求7所述核酸表达载体转化或转染入宿主细胞；
(3)培养宿主细胞，诱导权利要求7所述重组蛋白的表达。


9.蛋白复合物，包含权利要求1～6任一项所述的重组蛋白和聚乙二醇。


10.根据权利要求9所述的蛋白复合物，其特征在于，所述重组蛋白与聚乙二...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘凯，张洪杰，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11