新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用，所述疫苗的编码基因包括：含有新型冠状病毒的S蛋白受体结合域RBD中与ACE2结合的肽段序列、Kozak序列、IgG信号肽序列和人源IgG Fc结构域序列；所述Kozak序列和IgG信号肽序列位于所述RBD中与ACE2结合的肽段序列的5’端；所述人源IgG Fc结构域序列位于所述RBD中与ACE2结合的肽段序列的3’端。本发明专利技术采用来自S蛋白的编码序列的第1168～1569位(包含RBD中与ACE2结合的肽段片段)作为抗原蛋白的基因序列，并进行改造，提高抗原蛋白的表达能力、分泌能力和免疫原性，制备的DNA疫苗、蛋白质疫苗和mRNA疫苗直接或经佐剂包装后注入体内表达出相应抗原，诱导机体产生免疫应答，在COVID‑19预防和治疗领域具有广泛应用的前景。

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药
，涉及新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及新型冠状病毒重组蛋白疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
重组蛋白疫苗是将病原体最有效的抗原表位基因进行体外重组，构建在表达载体上，转化入细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞中，在一定的诱导条件下表达出大量的抗原蛋白，纯化后制备得到的疫苗。DNA疫苗又称为核酸疫苗或基因疫苗，是将抗原基因重组到真核表达载体后，直接或经包装注入体内表达出相应抗原的疫苗，外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，诱导特异性免疫应答。DNA疫苗被认为是继灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗之后的“第三代疫苗”。传统的疫苗如灭活疫苗和弱毒疫苗具有生产周期长、成本高等缺点，DNA疫苗的出现使得这一状况得到显著改善，该疫苗既具有减毒疫苗的优点，又无逆转的危险，还具有制备简单、成本低、不易被核酸酶降解、易于保存运输等优点。编码病毒、细菌和寄生虫等不同种类抗原基因的质粒DNA，目前已经应用于脊椎动物如哺乳类、鸟类和鱼类等多个物种，能够引起强烈而持久的免疫反应。mRNA翻译快速，起效快，本身具有激活免疫反应的作用；同时，mRNA药物生产简单、易于改造、合成快速、成本较低；更重要的是，mRNA药物不局限于分裂细胞，没有整合到宿主基因组中的风险，且会在体内自动降解。所以，mRNA疫苗的开发具有很大的优势。目前已开发的SARS等病毒的疫苗选择的是病毒的S蛋白或N蛋白作为抗原，对其进行的改造包括在S蛋白或N蛋白上添加外源病毒RNA输出元件(如Mazon-Pfizer猴病毒的CTE或土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的PRE)和IgGFc结构域。然而针对新型冠状病毒的疫苗还未见报道。防控新型冠状病毒引起的肺炎疫情是当前最重要的工作，目前对于新型冠状病毒引起的肺炎仍没有特异的治疗方法。预防性疫苗是遏制重大突发性传染疾病大规模流行的重要手段，因此迫切需要开发新型冠状病毒疫苗，以遏制疫情蔓延。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用，选择含有新型冠状病毒的S蛋白受体结合域(receptor-bindingdomain，RBD)中与ACE2结合的关键结合位点的肽段作为抗原并对其进行改造，将编码基因重组在表达载体上，构建重组蛋白疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗，直接或经佐剂包装后诱导机体产生免疫应答。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段、人源IgGFc结构域和分别连接所述肽段的羧基端和所述人源IgGFc结构域的氨基端的连接肽。本专利技术中，选择含有S蛋白受体结合域(receptor-bindingdomain，RBD)中与ACE2结合的关键结合位点的肽段作为抗原，原因在于新型冠状病毒通过其包膜上的S蛋白进入人体细胞，S蛋白的RBD负责与人体细胞表面的ACE2受体进行特异性识别结合；S蛋白的3D结构表明，RBD会上下移动，当向上移动时，S蛋白能够通过RBD与细胞表面的ACE2受体结合，当向下移动时，S蛋白中与ACE2受体结合的部位便隐藏起来，说明S蛋白的构象影响其与ACE2的结合能力，更重要的是RBD中的一段多肽直接与ACE2结合，称之为关键结合位点；因此，本专利技术选择S蛋白RBD中与ACE2结合的关键结合位点或含有S蛋白RBD中与ACE2结合的关键结合位点的肽段作为抗原分子。本专利技术中，以含有S蛋白RBD中与ACE2结合的关键结合位点的肽段作为抗原，与人源IgGFc结构域进行融合表达，增强了肽段的免疫原性，构建的融合蛋白有利于制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物。优选地，所述新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：LCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPAT。本专利技术中，如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列即为S蛋白RBD中与ACE2结合的关键结合位点。优选地，所述人源IgGFc结构域包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:2：ESKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。优选地，所述连接肽包括如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；SEQIDNO:3：GGGGSGGGGSGGGGS。优选地，所述融合蛋白包括如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；SEQIDNO:4：LCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATGTGGGGSGGGGSGGGGSESKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。优选地，所述融合蛋白还包括信号肽。优选地，所述信号肽包括IgG信号肽。本专利技术中，通过在融合蛋白的N端添加IgG信号肽，增强了融合蛋白的分泌能力，提高了融合蛋白的表达量。优选地，所述IgG信号肽包括如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；SEQIDNO:5：EFGLSWLFLVAALRGVQS。优选地，所述融合蛋白包括如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列；SEQIDNO:6：MEFGLSWLFLVAALRGVQSLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段、人源IgG Fc结构域和分别连接所述肽段的羧基端和所述人源IgG Fc结构域的氨基端的连接肽。/n

【技术特征摘要】
20200226 CN 20201011914971.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段、人源IgGFc结构域和分别连接所述肽段的羧基端和所述人源IgGFc结构域的氨基端的连接肽。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述人源IgGFc结构域包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述连接肽包括如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述融合蛋白包括如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；
优选地，所述融合蛋白还包括信号肽；
优选地，所述信号肽包括IgG信号肽；
优选地，所述IgG信号肽包括如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；
优选地，所述融合蛋白包括如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。


3.一种如权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括：新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段的核酸序列、Kozak序列、IgG信号肽的核酸序列和人源IgGFc结构域的核酸序列；
所述Kozak序列和IgG信号肽的核酸序列位于所述肽段的核酸序列的5’端；
所述人源IgGFc结构域的核酸序列位于所述肽段的核酸序列的3’端；
优选地，所述新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段的核酸序列包括如SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的核酸序列；
优选地，所述编码基因包括如SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所述的核酸序列。


4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求3所述的编码基因；
优选地，所述编码基因插于质粒的NheI和XhoI位点之间；
优选地，所述重组载体的启动子包括CMV启动子和/或T7启动子。


5.一种DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗包括如权利要求3所述的编码基因和/或如权利要求4所述的重组载体。


6.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋旭，刘丹，赵永云，李为民，张天宇，曾凡亚，缪辉，李佳，李晓杰，李灵，
申请(专利权)人：四川大学，中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：四川;51