用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法技术

本发明专利技术提出的一种用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，所述用于新型冠状病毒检测的抗原包括基于核衣壳蛋白的融合蛋白。该用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，通过融合技术获得含有新型冠状病毒的核衣壳蛋白的融合蛋白，使融合蛋白具有新型冠状病毒核衣壳蛋白天然空间结构特征的同时改善其性质，用于新型冠状病毒检测时灵敏度高、特异性强，更适宜用于新型冠状病毒检测以提高新型冠状病毒的检出率，确保新型冠状病毒肺炎的及时确诊，能够有效避免疫情的扩散。

【技术实现步骤摘要】
用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法
本专利技术涉及生物医药检测领域，特别是涉及一种用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法。
技术介绍
新型冠状病毒肺炎(CoronaVirusDisease2019，COVID-19)是由感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2，亦称2019-nCoV)引起的以肺部病变为主的新发传染病，可引起消化系统和神经系统的损伤，严重者可导致死亡。目前针对2019-nCoV的还没有特效治疗药物，疫苗也处于临床试验阶段，患者的早诊断、及时收治和隔离对有效控制疫情至关重要。新冠病毒感染的大量排查主要还是采用核酸检测，核酸检测因其敏感性强成为疑似病例确诊的金标准，但该技术对实验场所及人员要求高、操作繁琐、受环境条件影响比较大，容易受气溶胶的污染出现假阳性。传统的抗原抗体反应是临床实验室检测的重要补充，利用抗原去检测感染者血清中的抗体是快速筛查和核酸辅助诊断的重要手段。目前很多公司已经开发出通过血清学诊断方法用于COVID-19临床诊断的检测试剂盒，如胶体金法和传统ELISA方法，筛选出SARS-CoV-2中保守的具有优势表位的抗原或联合抗原是血清学诊断成功的关键。SARS-CoV-2基因大小约为29.8kb，基因组被注释为含有14个开放阅读框(Openingreadingframe，ORF)，共编码27～28个蛋白质。核衣壳蛋白(N蛋白)是SARS-CoV-2的一种主要的结构蛋白，其位于病毒内部，是干扰素(Interferon，IFN)的拮抗剂和病毒编码的RNA干扰抑制因子，与病毒的复制有关，N蛋白在β属冠状病毒之间相对比较保守，合成数量众多，具有很强抗原性，在诱导宿主免疫应答甚至发病机制中发挥重要作用，常被用作冠状病毒诊断的抗原位点。但是现有的直接基于N蛋白作为抗原用于检测SARS-CoV-2的方法检出率低，影响COVID-19的确诊效率及疫情的控制。
技术实现思路
基于此，有必要针对现有的直接基于N蛋白作为抗原用于检测SARS-CoV-2的方法检出率低，影响COVID-19的确诊效率及疫情的控制的问题，提供一种用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法。本专利技术提出的一种用于新型冠状病毒检测的抗原，所述用于新型冠状病毒检测的抗原包括基于核衣壳蛋白的融合蛋白。在其中的一个实施例中，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白为可溶性蛋白。在其中的一个实施例中，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白为核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶A的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白；或，核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶C的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白。在其中的一个实施例中，所述二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列为如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的突变序列；所述二硫化物氧化还原酶C的核苷酸序列为如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列或如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列的突变序列；所述核衣壳蛋白的核苷酸序列为如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列或如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的突变序列。在其中的一个实施例中，所述核衣壳蛋白的核苷酸序列与所述二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列的C端直接连接或通过接头连接；所述核衣壳蛋白的氨基酸序列与所述二硫化物氧化还原酶C的氨基酸序列的C端直接连接或通过接头连接。在其中的一个实施例中，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白通过原核表达系统表达生成。本专利技术还提出了一种用于新型冠状病毒检测的抗原的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：根据如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列合成核衣壳蛋白基因片段；通过内切酶SalⅠ以及内切酶NheⅠ将所述核衣壳蛋白基因片段从克隆载体上切下；将所述核衣壳蛋白基因片段克隆到载体PET-DsbA或PET-DsbC上，转化到原核表达系统中诱导表达生成基于核衣壳蛋白的融合蛋白。在其中的一个实施例中，合成所述核衣壳蛋白基因片段的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；合成所述核衣壳蛋白基因片段的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。在其中的一个实施例中，所述制备方法还包括以下步骤：对所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白进行亲和纯化和/或凝胶纯化。在其中的一个实施例中，所述原核表达系统为大肠杆菌。上述用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，通过融合技术获得含有新型冠状病毒的核衣壳蛋白的融合蛋白，使融合蛋白具有新型冠状病毒核衣壳蛋白天然空间结构特征的同时改善其性质，用于新型冠状病毒检测时灵敏度高、特异性强，更适宜用于新型冠状病毒检测以提高新型冠状病毒的检出率，确保新型冠状病毒肺炎的及时确诊，能够有效避免疫情的扩散。进一步地，上述用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，基于核衣壳蛋白的融合蛋白为可溶性蛋白，该可溶性蛋白可以以上清的形式存在，在用于血清学检测时能够有效提高新型冠状病毒抗体的检出率，确保检测的准确性。更进一步地，上述用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法，将新型冠状病毒的核衣壳蛋白与二硫化物氧化还原酶A或二硫化物氧化还原酶C进行融合表达，充分利用二硫化物氧化还原酶C的二硫键异构酶和分子伴侣的生物特性，提高融合蛋白可溶性，促使融合蛋白在重组表达过程中以上清的形式存在，进而提高新型冠状病毒抗体的检出率，为血清学检测试剂盒打下物质基础。附图说明图1为本专利技术实施例1的SARS-CoV-2N蛋白核苷酸分子量凝胶电泳鉴定结果图；图2为本专利技术实施例1DsbC-N融合蛋白在原核系统内表达形式鉴定结果图；图3为本专利技术实施例1纯化后DsbC-N融合蛋白的纯度鉴定结果图；图4为本专利技术DsbC-N融合蛋白用于ELISA实验的检测结果图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本专利技术，但并不用于限定本专利技术。截止到2020年8月20日，世界感染SARS-CoV-2的人数超过2000万，在早期检测中，核酸检测发挥了巨大作用，达到了早诊断、早隔离的目的。随着新冠病毒的基因组序列的解析出来，各个结构蛋白的表达序列被测序，重组诊断抗原开始发挥作用。病毒感染机体时，在机体血清抗体中，IgM抗体出现最早，是急性期感染的诊断指标，但IgM浓度低、维持时间只有一周左右并且亲和力低；IgG抗体产生较晚，能提示染中后期或者是具有既往感染的产生，并且IgG抗体具有浓度高、维持时间长、亲和力高。目前已有多家生物公司研发出检测SARS-CoV-2IgM和IgG抗体的诊断方法，为新型冠状病毒感染的辅助诊断和流行病调查提供了一个极好的检测手段。抗体检测的特异性与抗原位点的保守性密切相关，SARS-CoV-2的N蛋白是COVID-19检测的主要抗原位点，目前临床新冠病毒检测试剂盒大多采用N蛋白抗原或者刺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述用于新型冠状病毒检测的抗原包括基于核衣壳蛋白的融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述用于新型冠状病毒检测的抗原包括基于核衣壳蛋白的融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白为可溶性蛋白。


3.根据权利要求2所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述基于核衣壳蛋白的融合蛋白为核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶A的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白；或，核衣壳蛋白的氨基酸序列或部分氨基酸序列与二硫化物氧化还原酶C的氨基酸序列或部分氨基酸序列融合表达生成的融合蛋白。


4.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列为如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的突变序列；
所述二硫化物氧化还原酶C的核苷酸序列为如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列或如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列的突变序列；
所述核衣壳蛋白的核苷酸序列为如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列或如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列的突变序列。


5.根据权利要求4所述的用于新型冠状病毒检测的抗原，其特征在于，所述核衣壳蛋白的核苷酸序列与所述二硫化物氧化还原酶A的核苷酸序列的C端直接连接或通过接头连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯江厚，孙卫国，张灵霞，黄国红，杨奕梅，李夏南，翟斐，
申请(专利权)人：昆明市妇幼保健院，中国人民解放军总医院第八医学中心，
类型：发明
国别省市：云南;53