万古霉素完全抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了万古霉素完全抗原及其在万古霉素特异性单克隆抗体制备和免疫法检测中的应用。本发明专利技术还公开了用该完全抗原制备的抗万古霉素单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞以及用于检测万古霉素的检测卡和检测试剂盒。本发明专利技术公开了检测万古霉素的ELISA法和荧光免疫层析法，本发明专利技术的荧光免疫层析法具备操作简单、检测时间短、成本低、特异性高、重复性好等优点。

【技术实现步骤摘要】
万古霉素完全抗原及其制备方法和应用
本专利技术涉及小分子药物的检测。具体地说，本专利技术涉及万古霉素完全抗原、利用该完全抗原获得的万古霉素单克隆抗体及其在荧光免疫层析法检测万古霉素中的应用。
技术介绍
近年，由于临床抗菌药物广泛应用及不合理使用导致细菌的耐药问题的日益严重。为对抗迅速增长耐药菌，许多制药公司都积极研发新的抗菌药。万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌所致的重症感染包括败血症、肺部感染、皮肤软组织感染的疗效确切又比较安全的抗生素。对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌院内肺部感染，万古霉素为首选药物。现在，在多个国家出现的“超级细菌”可以抵御几乎所有抗生素，目前最好的抗生素是替加环素和万古霉素。然而，抗菌药物在治愈并挽救了无数患者生命的同时，也因抗菌药物的不合理应用也会造成耐药菌增加的不利后果。不合理用药是事关全人类健康的大事，是全世界所有国家普遍存在的问题。我国药物的不合理情况亦非常严重，据国家食品药品监督管理局通报，每年至少有20万人因用错药、用药不当而死亡，40％死于抗菌药物应用不合理。合理用药的问题一直是专业人士和公众关注的热点。因此，对患者有必要进行血药浓度的监测，以确保药物的有效治疗，优化万古霉素的临床使用，减少耐药菌株的产生及不良反应的发生。要达到此目的需建立简便、快速、灵敏、可靠的万古霉素定量检测方法。目前，万古霉素的检测主要包括高效液相色谱法、免疫分析法和液质联用技术等。高效液相色谱法是最早用于测定万古霉素血药浓度的方法，该法具有准确、灵敏、廉价的特点，但该法操作繁琐、重现性较差、难以实现自动化检测，且测定时间较长，检测浓度有限。近年来虽然国内外一直出现试图在进行对高效液相色谱法测定精神类药物血药浓度的技术改进，如直接蛋白沉淀法结合反相液相色谱法、固相萃取结合高相液相、直接蛋白沉淀结合色谱质谱联用等，但仍存在各自的局限。此外，免疫分析法也是万古霉素检测的常用方法。荧光偏振免疫法在十多年前就被开发成商品化的仪器，实现了自动化检测。但其最大的缺陷在于专属性不强，测定时易受代谢物的干扰。酶放大免疫法，该技术监测血药浓度具有较好的精密度和准确度，虽已实现商品化，但由于其费用太高，给患者带来沉重的经济负担，导致临床上推广使用困难。影响免疫分析法检测质量的根本原因是抗体的特异性与亲和性，这些性质又取决于免疫半抗原的分子结构，所以免疫半抗原分子设计与选择是产生特异性抗体和建立小分子药物含量快速检测技术最关键的步骤。因此，本领域急需万古霉素的完全抗原，以及通过该完全抗原获得的万古霉素特异性抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供万古霉素的完全抗原，通过该完全抗原可以获得万古霉素的特异性抗体。本专利技术的另一目的在于提供通过本专利技术的万古霉素完全抗原获得的万古霉素特异性抗体以及包含该抗体的检测试剂盒和定量测定万古霉素的方法。在第一方面，本专利技术提供一种万古霉素完全抗原，所述完全抗原具有式I所示的结构：式中，R为任选取代的C1-C6烷基；优选任选取代的C2-C4烷基；Protein为蛋白质载体。在具体的实施方式中，所述完全抗原具有式II所示的结构：式中，Protein为蛋白质载体。在优选的实施方式中，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。在具体的实施方式中，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。在第二方面，本专利技术提供一种制备第一方面所述的万古霉素完全抗原的方法，所述方法包括步骤：将万古霉素通过连接试剂与蛋白质载体连接，以制得权利要求所述的完全抗原。在优选的实施方式中，所述连接试剂是戊二醛。在优选的实施方式中，所述蛋白质载体为选自下组中的任何一种蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等。在进一步的优选实施方式中，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)、或卵清蛋白(OVA)。在第三方面，本专利技术提供第一方面所述的万古霉素完全抗原的用途，用于制备万古霉素的特异性单克隆抗体。在第四方面，本专利技术提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合万古霉素。在优选的实施方式中，所述单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞系产生，所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCCNO:C202032；分类命名为：杂交瘤细胞株C214231。在优选的实施方式中，所述的单克隆抗体检测万古霉素的灵敏度低于1ng/ml；优选低于0.8ng/ml；更优选约为0.6ng/ml。在第五方面，本专利技术提供一种产生第四方面所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述杂交瘤细胞系由中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉，武汉大学)保藏，保藏号为CCTCCNO:C202032；分类命名为：杂交瘤细胞株C214231。在第六方面，本专利技术提供第四方面所述的单克隆抗体的用途，用于制备检测样品中万古霉素的试剂、检测卡或试剂盒。在优选的实施方式中，所述样品是生物样品，优选血液样品。在第七方面，本专利技术提供一种检测样品中是否存在万古霉素的方法，所述方法包括步骤：(a)将所述样品与第四方面所述的单克隆抗体接触；(b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在万古霉素。在优选的实施方式中，所述单克隆抗体带有可检测标记物；优选地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。在优选的实施方式中，所述检测方法为荧光检测法。在优选的实施方式中，所述检测方法是体外非诊断性的。在第八方面，本专利技术提供一种检测万古霉素的荧光免疫层析检测卡，所述检测卡包括基片；吸液部件；检测部件；加样部件，其特征在于，检测部件固定在基片上，在检测部件中部设置质控带和检测带，在检测部件的两端以部分重叠的方式固定吸液部件和加样部件，其中，检测带上包被有本专利技术第一方面所述的万古霉素完全抗原，质控带上包被有兔抗体IgG。在优选的实施方式中，所述万古霉素荧光免疫层析检测卡还包括卡盒，所述卡盒由下盖和上盖组成，上盖设有加样窗口和检测窗口，所述万古霉素荧光免疫层析检测卡完全设置于下盖中，所述检测窗口和加样窗口分别对应与所述万古霉素荧光免疫层析检测卡上的加样部件和质控带及检测带。在优选的实施方式中，所述上盖上还设有产品编号区；条形码识别区。在优选的实施方式中，所述基片是深色硬质基片；优选黑色PVC基片。在优选的实施方式中，所述检测部件是硝酸纤维素膜。在优选的实施方式中，所述加样部件是玻璃纤维。在优选的实施方式中，所述吸液部件是吸水纸。在第九方面，本专利技术提供一种检测万古霉素的检测试剂盒，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种万古霉素完全抗原，所述完全抗原具有式I所示的结构：/n

【技术特征摘要】
1.一种万古霉素完全抗原，所述完全抗原具有式I所示的结构：



式中，R为任选取代的C1-C6烷基；优选任选取代的C2-C4烷基；
Protein为蛋白质载体。


2.如权利要求1所述的万古霉素完全抗原，其特征在于，所述完全抗原具有式II所示的结构：



式中，Protein为蛋白质载体。


3.如权利要求2所述的万古霉素完全抗原，其特征在于，所述蛋白质载体是牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。


4.一种制备权利要求1-3中任一项所述的万古霉素完全抗原的方法，所述方法包括步骤：
将万古霉素通过连接试剂与蛋白质载体连接，以制得权利要求所述的完全抗原。


5.权利要求1-3中任一项所述的万古霉素完全抗原的用途，用于制备万古霉素的特异性单克隆抗体。


6.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合万古霉素。

...

【专利技术属性】
技术研发人员：何扬锦，陈颖，吴杰，张丽平，
申请(专利权)人：浙江准策生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33