一种ELP-Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种类弹性蛋白(Elastin‑like polypeptides，ELPs)和Ⅲ型胶原蛋白(collagen Ⅲ)的融合蛋白的纯化和复性的方法。本发明专利技术将类弹性蛋白标签ELP100与Ⅲ型胶原蛋白多肽基因连接到原核表达载体pRELPN上，构建成pRELPN‑CLP Ⅲ‑ELP100融合蛋白表达载体，该载体在BL21(DE3)大肠杆菌中高表达。由于该蛋白在大肠杆菌中以胞内包涵体的形式存在，所以我们采用包涵体纯化和复性的方法来对该融合蛋白进行纯化和复性，包括如下步骤：菌种的收集与破碎，洗除杂蛋白、脂质和核酸，蛋白精纯化，滴定稀释法复性，ITC纯化和MTT细胞法活性鉴定，本方法纯化得率高、方法简单，适合于大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种ELP-Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法及应用
本专利技术涉及生物
，尤其是一种ELP-Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法及应用。
技术介绍
类弹性蛋白多肽(ELPs)是一种经过人工改造的、具有弹性且随温度变化会发生相变的基因工程多肽，因其在结构上以五肽重复序列单元串联构成而形成聚合物，即(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG)，其中，可以Xaa是除了脯氨酸以外的任何一种氨基酸，通常为缬氨酸(Val，V),丙氨酸(Ala,A),甘氨酸(Gly,G)亮氨酸(Leu,L)异亮氨酸(Ile,I)，赖氨酸(Lys,K),苯丙氨酸(Phe,F),组氨酸(His,H)等几种氨基酸类型，重复单元n通常为20-120不等。目前主要合成的方法有两种，一种化学合成法合成多肽，另一种是基因重组合成法。与化学合成法相比，基因重组合成法具有以下优点：1.通过基因编码精确控制ELPs的氨基酸序列、分子量、空间折叠结构以及相应的生化性质；2.构建所得包含ELPs基因的质粒载体可长久保存于表达菌株，进行可持续生产；3.ELPs能够在宿主菌折叠机制的辅助作用下正确折叠成具有活性的二级结构或三级结构，通过后期可溶性蛋白的纯化，可直接进行应用研究。ELPs有个最大的特性：温度敏感性。在低温时，ELPs可溶于水，聚合物链保持无序的结构，且相当伸展。当温度升高到一个临界温度，ELPs将不溶于水，含水的多肽链结构就会瓦解并开始聚集，最终以富含ELPs的聚集物的形式沉淀析出，这个临界温度称为ELPs的相变温度(transitiontemperature，Tt)，这个过程是可逆的，所以经常采用逆相变循环(Inversetransitioncycling,ITC)来对含有ELP标签的融合蛋白进行纯化。本专利技术根据本公司发表专利申请号20181003668.1描述的pRELPN载体促进克隆在ELP融合蛋白后起始密码ATG后的外源目的基因独立高表达，该融合蛋白本身极少表达，并且轻微抑制大肠杆菌或真核细胞等宿主自身蛋白的表达，促进外源目的基因的重组蛋白积聚和高表达，从而有助于解决普通表达载体对外源基因或外源基因与ELP组成的融合基因的低表达或不表达导致不能产业化的问题。III型胶原蛋白是一种成纤维胶原，在血管中的含量很高，起着重要作用。一方面它能增强血管的强度与弹性，另一方面它提供细胞充足的营养。III型胶原蛋白还能直接与血管母细胞结合，从而形成新血管。III型胶原蛋白是维持皮肤饱满、润滑、有光泽的重要元素。III型胶原蛋白进入人体后，能迅速被人体吸收，补充皮肤中随着年龄的增加而逐渐减少的胶原蛋白。从而使得皮肤具有弹性、水分充足并且能够明显减少人的鱼尾纹与抬头纹。目前主要有以下几种途径生产胶原蛋白：传统提取法、化学合成法、现代生物技术生产法。传统提取主要是通过酸法、碱法和酶法从动物皮毛和结缔组织中获得，所获得的胶原蛋白活性较低，且带有安全隐患。随着基因工程和生物技术的发展，从19世纪80年代以来，人们开始利用生物技术方法生产胶原蛋白，并得到推广，以满足人们对胶原蛋白的迫切需求，同时也节约成本，为工业生产胶原蛋白带来更大的经济效益。但依然存在许多问题，比如：蛋白纯化复杂，需要经过离子交换、分子排阻等一系列层析方法纯化，成本高昂。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：为了解决上述
技术介绍
中存在的问题，提供一种改进的ELP-Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法及应用，解决上述
技术介绍
中存在的问题。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种ELP-Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法，包含下列步骤：第一步：合成ELP100基因序列，并构建pET28a-BamH-ELP100-NdeI重组载体，并导入到DH5a大肠杆菌中，然后构建pRELPN-BamH-ELP100-NdeI重组质粒，并导入到DH5a大肠杆菌中；第二步：合成III型胶原蛋白基因，构建pRELPN-BamHI-ELP100-NdeI-CLPⅢ-XhoI重组质粒，并转染到大肠杆菌BL21(DE3)中表达；第三步：对大肠杆菌进行均质破碎得到含有目的蛋白的包涵体，利用非色谱的方法对目的蛋白进行粗纯和精纯；第四步：通过滴定稀释法来对包涵体进行复性，再用超滤对复性的目的蛋白进行浓缩；第五步：利用逆相变循环(Inversetransitioncycling,ITC)来对复性后的融合蛋白进行纯化；第六步：用MTT法对ITC纯化后的ELP和III型胶原蛋白的融合蛋白进行活性检测。所述的Ⅲ型胶原蛋白是一个含30个氨基酸的八个重复片段组成(CLPIII)，Ⅲ型胶原蛋白分子质量为27kDa。所述的ELP为由100个串联的五肽重复单元(Val-Pro-Gly-His-Gly，VPGHG)通过酶切位点间隔连接或克隆形成的类弹性蛋白多肽。所述的融合蛋白是由ELP标签和Ⅲ型胶原蛋白组成的，中间通过BamHI酶切位点连接，其相对分子量为73kDa。所述pRELPN-BamHI-ELP100-NdeI-CLPⅢ-XhoI重组质粒的构建方式如下：(1)合成ELP100基因，并将其插在pET28a载体的BamHI和NdeI酶切位点之间，形成pET28a-BamH-ELP100-NdeI载体。(2)利用PCR扩增出BamHI-ELP100-NdeI片段，将其连接到载体pRELPN上，构成pRELPN-BamHI-ELP100-NdeI重组载体。(3)合成出Ⅲ型胶原蛋白基因，将其插入在pRELPN-BamHI-ELP100-NdeI重组载体的NdeI和XhoI酶切位点之间，构成pRELPN-BamHI-ELP100-NdeI-CLPⅢ-XhoI重组质粒。一种ELP-Ⅲ型胶原蛋白的应用，所述的ELP100-CLPⅢ融合蛋白具有促进细胞生长作用。本专利技术的有益效果是：本专利技术的一种改进的ELP-Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法及应用可用于在工业上大规模制备类人胶原蛋白，不仅适用于ELP-III型胶原蛋白的纯化和复性，也可用于其他以包涵体形式存在的重组蛋白质的分离、纯化以复性，包括如下步骤：菌种的收集与破碎，洗除杂蛋白、脂质和核酸，蛋白精纯化，滴定稀释法复性，ITC纯化和MTT细胞法活性鉴定，本方法纯化得率高、方法简单，适合于大规模生产。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1ELP-III型胶原蛋白纯化蛋白电泳图。图2ELP-III型胶原蛋白复性及ITC纯化图。图3明胶或ELP-III型胶原蛋白融合蛋白对细胞增殖的促进率。图4不同条件处理L929细胞24h后的细胞形态对比图。图5培养72h后不同浓度ELP-Ⅲ型胶原蛋白融合蛋白对细胞增殖的促进率。图6不同浓度ELP-III型胶原蛋白融合蛋白处理L929细胞24h后的细胞形态对比图。具体实施方式现在结合附图对本专利技术作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本专利技术的基本结构，因此其仅显示与本专利技术有关的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ELP-Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，包含下列步骤：/n第一步：合成ELP100基因序列，并构建pET28a-BamH-ELP100-NdeI重组载体，并导入到DH5a大肠杆菌中，然后构建pRELPN-BamH-ELP100-NdeI重组质粒，并导入到DH5a大肠杆菌中；/n第二步：合成III型胶原蛋白基因，构建pRELPN-BamHI-ELP100-NdeI-CLPⅢ-XhoI重组质粒，并转染到大肠杆菌BL21(DE3)中表达；/n第三步：对大肠杆菌进行均质破碎得到含有目的蛋白的包涵体，利用非色谱的方法对目的蛋白进行粗纯和精纯；/n第四步：通过滴定稀释法来对包涵体进行复性，再用超滤对复性的目的蛋白进行浓缩；/n第五步：利用逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)来对复性后的融合蛋白进行纯化；/n第六步：用MTT法对ITC纯化后的ELP和III型胶原蛋白的融合蛋白进行活性检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种ELP-Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法，其特征在于，包含下列步骤：
第一步：合成ELP100基因序列，并构建pET28a-BamH-ELP100-NdeI重组载体，并导入到DH5a大肠杆菌中，然后构建pRELPN-BamH-ELP100-NdeI重组质粒，并导入到DH5a大肠杆菌中；
第二步：合成III型胶原蛋白基因，构建pRELPN-BamHI-ELP100-NdeI-CLPⅢ-XhoI重组质粒，并转染到大肠杆菌BL21(DE3)中表达；
第三步：对大肠杆菌进行均质破碎得到含有目的蛋白的包涵体，利用非色谱的方法对目的蛋白进行粗纯和精纯；
第四步：通过滴定稀释法来对包涵体进行复性，再用超滤对复性的目的蛋白进行浓缩；
第五步：利用逆相变循环(Inversetransitioncycling,ITC)来对复性后的融合蛋白进行纯化；
第六步：用MTT法对ITC纯化后的ELP和III型胶原蛋白的融合蛋白进行活性检测。


2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征是：所述的Ⅲ型胶原蛋白是一个含30个氨基酸的八个重复片段组成(CLPIII)，Ⅲ型胶原蛋白分子质量为27kDa。


3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征是：所述的ELP为由100个...

【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，
申请(专利权)人：点斗基因科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32