CLTX-NKG2D双特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于嵌合抗原受体细胞领域，具体涉及一种靶向人CLTX‑R和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的编码氨基酸序列，及其修饰的免疫应答细胞及其制备方法和应用。本发明专利技术涉及一种双特异性靶向人NKG2DL和氯毒素受体（CLTX‑R）的蛋白或其功能性变体的双特异性嵌合抗原受体，其修饰的免疫应答细胞及其制备方法和应用；获得的新型功能化免疫应答细胞能有效地靶向攻击多种肿瘤，及制备用于治疗恶性肿瘤的制剂。本发明专利技术的靶向CLTX‑R和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞能增强与肿瘤细胞的结合，明显提高抗肿瘤活性。

【技术实现步骤摘要】
CLTX-NKG2D双特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
本专利技术属于嵌合抗原受体细胞领域，涉及一种靶向人CLTX-R和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的氨基酸编码序列、及其修饰的免疫应答细胞，以及它们的制备方法和在药物制备中的应用。
技术介绍
随着生物技术的飞速发展，免疫细胞治疗已成为癌症治疗领域的第四大疗法。癌症免疫疗法主要包括过继性细胞治疗、免疫调节剂、肿瘤疫苗以及免疫结合点阻断治疗等。其中，在细胞治疗领域，CAR-T疗法无疑已成为研究机构和制药公司争相“追捧”的明星。CAR-T(ChimericAntigenReceptorT-Cell，嵌合抗原受体修饰的T细胞)为代表的免疫疗法，其原理主要是通过基因工程手段对病人自身提取的T细胞进行嵌合抗原受体的修饰形成CAR-T细胞，该T细胞能特异性地识别肿瘤表面相关抗原(肿瘤细胞标志物)，从而靶向杀伤肿瘤。近年研究表明，NKG2DL蛋白的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，其在健康组织中很少有表达或仅短暂地表达，而通常在不同来源的各种肿瘤细胞表面有较高水平的表达。NKG2DL蛋白的受体为NKG2D，研究显示，NKG2D-NKG2DL系统在机体的抗肿瘤免疫中发挥着重要作用，NKG2D通过识别肿瘤细胞表面产生的NKG2DL来传递活化信号并激活免疫系统，从而对肿瘤细胞发挥杀伤作用。除此之外，研究发现自身免疫性疾病患者的血清中含有可溶性NKG2DL，NKG2D-NKG2DL系统在治疗自身免疫性疾病、抗炎、抗衰老等方面起到一定作用(参见LegrouxL等人，FrontiersinImmunology，(2019))。因此，NKG2DL的表达作为机体发生肿瘤时肿瘤细胞上的一个特异性的改变，为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，为相关新疗法和药物的开发提供了启示。据报道，氯毒素(chlorotoxin，CLTX)可以与多种膜蛋白结合，CLTX-R为CLTX的受体，包括MMP-2、CLCN3、ANXA2等，具体为膜相关基质金属蛋白酶2(MMP2)、氯离子通道CLCN3和磷脂蛋白annexinA2(ANXA2)(参见Wang等人，Sci.Transl.Med.，2020)。CLTX被证实可广泛且特异性地结合胶质瘤和其他神经外胚层肿瘤，同时与脑和其他部位的非恶性细胞表现出极低的交叉反应性。一些胚胎相关肿瘤，包括黑素瘤，也被证明表达MMP-2并结合CLTX。CLTX本身对肿瘤和正常组织无细胞毒性，可以安全地用于特异性靶向肿瘤。有研究表明CLTX-CART细胞治疗原位异种移植瘤模型小鼠可使肿瘤消退，CLTX-CART细胞对正常细胞或在过继转移到小鼠后均不表现出可观察到的脱靶效应活性。综上所述，我们构建了基于NKG2D-NKG2DL系统的激活性靶标NKG2D和使用CLTX及其突变肽作为靶向肿瘤区域的双特异性嵌合抗原受体修饰的新型高特异性杀伤力的免疫应答细胞用于肿瘤的治疗。
技术实现思路
鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本专利技术的目的是为了克服现有肿瘤临床技术中面临的肿瘤内环境中效应细胞杀死肿瘤细胞的特异性不强和杀伤效率不高的问题，提供靶向人CLTX-R和NKG2DL的双特异性靶向结合多肽结构域或其功能性变体、靶向人CLTX-R和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体或其功能性变体、及其编码核苷酸序列和其表达载体、工程化的靶向CLTX-R和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞及其应用。本专利技术的工程化的靶向CLTX-R和NKG2DL体的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞能够地提高肿瘤细胞的特异性杀伤效率，避免脱靶带来的治疗毒性安全问题，可增强与肿瘤细胞的结合，从而提供了一种具有应用前景的肿瘤治疗的新手段。技术方案一种特异性靶向人CLTX-R和NKG2DL的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于所述的免疫细胞含有嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列为：从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人CLTX-R和NKG2DL的胞外识别结构域氨基酸序列、铰链区氨基酸序列、跨膜结构域氨基酸序列、胞内信号结构域的氨基酸序列；或从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人NKG2DL和CLTX-R胞外识别结构域氨基酸序列、铰链区氨基酸序列、跨膜结构域氨基酸序列、胞内信号结构域的氨基酸序列；所述靶向结合人CLTX-R的胞外识别结构域氨基酸序列为：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的结合CLTX的氨基酸序列；或与所示SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。所述靶向结合人NKG2DL的胞外识别结构域氨基酸序列为：SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9或SEQIDNo.10所示的靶向结合人NKG2DL蛋白的人NKG2D的氨基酸序列；或与所示SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9或SEQIDNo.10氨基酸序列具有80～99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。其中所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；所述的免疫细胞，其特征在于：编码所述的特异性靶向人CLTX-R和NKG2DL的嵌合抗原受体的核酸分子，包括从5’到3’依次串联连接的编码所述引导序列的核苷酸序列、编码所述靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白受体核苷酸序列、编码靶向结合人CLTX-R的胞外识别结构域的核苷酸序列、编码铰链区的核苷酸序列，编码所述跨膜结构域的核苷酸序列、编码所述胞内信号结构域的核苷酸序列；或编码所述的特异性靶向人CLTX-R和NKG2DL的嵌合抗原受体的核酸分子，包括从5’到3’依次串联连接的编码所述引导序列的核苷酸序列、编码靶向结合人CLTX-R的胞外识别结构域的、编码靶向结合人NKG2DL的人NKG2D蛋白受体的核苷酸序列、编码铰链区的核苷酸序列，编码所述跨膜结构域的核苷酸序列、编码所述胞内信号结构域的核苷酸序列；一种特异性靶向人CLTX-R和NKG2DL的嵌合抗原受体的重组载体或表达质粒，其特征在于包含所述的核酸分子。所述重组载体或表达质粒，其特征在于重组载体或表达质粒含有启动子，其中所述启动子包括EF1α长启动子，或EFS短启动子。一种重组病毒，其特征在于包括所述的重组载体的核苷酸序列和病毒颗粒；所述病毒包括慢病毒、腺病毒、腺联病毒或逆转录病毒。所述的免疫细胞在制备抗脑癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肠癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、食道癌、肾癌或胰腺癌药物中的应用。具体说明第一方面，本申请提供了一种特异性靶向人CLTX-R和NKG2DL的嵌合抗原受体：所述靶向结合人CLTX-R的CLTX氨基酸序列为：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性靶向人CLTX-R和NKG2DL的嵌合抗原受体，其特征在于：/n所述的嵌合抗原受体包括：/n靶向人CLTX-R蛋白的胞外识别结构域氨基酸序列：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQID No.4所示的靶向结合CLTX-R蛋白的CLTX的氨基酸序列；或与上述氨基酸序列具有80~99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体；/n靶向人NKG2DL蛋白的胞外识别结构域氨基酸序列：SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ IDNo.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示的靶向结合人NKG2DL蛋白的人NKG2D的氨基酸序列；或与上述氨基酸序列具有80~99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。/n

【技术特征摘要】
1.特异性靶向人CLTX-R和NKG2DL的嵌合抗原受体，其特征在于：
所述的嵌合抗原受体包括：
靶向人CLTX-R蛋白的胞外识别结构域氨基酸序列：SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的靶向结合CLTX-R蛋白的CLTX的氨基酸序列；或与上述氨基酸序列具有80~99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体；
靶向人NKG2DL蛋白的胞外识别结构域氨基酸序列：SEQIDNo.5、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9或SEQIDNo.10所示的靶向结合人NKG2DL蛋白的人NKG2D的氨基酸序列；或与上述氨基酸序列具有80~99％同源性的经过氨基酸修饰产生的变体。


2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列为：
从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人CLTX-R蛋白的胞外识别结构域氨基酸序列、靶向结合人NKG2DL蛋白的胞外识别结构域氨基酸序列、铰链区氨基酸序列、跨膜结构域氨基酸序列、胞内信号结构域氨基酸序列；或从氨基端到羧基端顺次连接的引导序列的氨基酸序列、靶向结合人NKG2DL蛋白的胞外识别结构域氨基酸序列、靶向结合人CLTX-R的胞外识别结构域氨基酸序列、铰链区氨基酸序列、跨膜结构域氨基酸序列、胞内信号结构域氨基酸序列；
所述跨膜结构域包含CD8跨膜结构区、或CD28跨膜结构区、或4-1BB跨膜结构区、或OX40跨膜结构区、或ICOS跨膜结构区；
其中所述胞内信号结构域包括免疫受体酪氨酸活化基序和共刺激信号域；
所述免疫受体酪氨酸活化基序包含CD3ζ链的胞内信号结构域或FcεRIγ胞内信号结构；
所述共刺激信号域包含CD28胞内信号结构域、4-1BB胞内信号结构域、OX40胞内信号结构域或ICOS胞内信号结构域；
所述共刺激信号域包含CD28和4-1B...

【专利技术属性】
技术研发人员：代红久，徐慧，李晓宇，朱靓婧，
申请(专利权)人：南京凯地医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32