本发明专利技术属于生物制药技术领域，具体涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)及其应用，该嵌合抗原受体以靶向CD19的单域抗体为抗原结合域，对CD3ζ结构域进行改造，缺失了部分ITAM1和ITAM3，保留原始ITAM2，并优化了ITAM2中部分氨基酸序列，可以提高CAR‑T内体存活时间，降低炎症因子表达水平，具有较好的临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)及其应用
本专利技术属于生物制药领域，具体涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)及其应用，尤其是涉及一种CD3ζ信号域经改造的嵌合抗原受体及其应用
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是指被高亲和性的嵌合抗原受体修饰的具有杀伤作用的T细胞，被基因修饰后的T细胞能够特异性地识别肿瘤抗原，识别后可激活T细胞使其大量增殖并通过免疫反应杀伤肿瘤细胞。CAR-T细胞技术的发展经历了一定的曲折和探索，第一代CAR-T细胞内只有单一信号分子，能够特异性识别靶抗原，但是缺乏协同刺激分子不能持续有效杀伤肿瘤细胞，所以无法充分激活是第一代CAR-T细胞的最主要缺陷，正因如此，第一代CAR-T细胞多用于理论研究，由于效果不佳这种新型细胞免疫疗法长期没有受到人们的关注。第二代CAR-T细胞借鉴了T细胞的双激活理论，在第一代的基础上增加了一个协同刺激分子，提高了第二代CAR-T细胞的增值分泌能力和持久性，从而增强了其抗癌效应。受到第二代CAR-T细胞成功的启发，研究人员尝试在第二代的基础上整合两个及以上的协同刺激分子，从而构建了第三代CAR-T细胞，提高了CART细胞的存活时间，进一步增强CAR-T细胞的抗癌效应。由于人体内存在多种抗肿瘤信号通路，研究人员试图将CAR-T细胞技术与其他肿瘤免疫疗法结合，故在第三代的基础上形成嵌合其他抗肿瘤信号通路的新型免疫治疗细胞，从而构成了第四代CAR-T细胞，在所选择的其他肿瘤信号通路中常用的包括IL-2、IL-12、TNF-α等抗肿瘤因子，以及PD-1、PD-L1和CTLA4等肿瘤免疫检查点。在现有的CAR-T细胞中，最常用的靶点为CD19。2017年8月，FDA批准了全球第一个治疗急性B淋巴细胞白血病(B-cellprecursoracutelymphoblasticleukemia，B-ALL)的CAR-T新药Kymriah，其Ⅱ期临床试验结果显示，75例3-21岁复发或难治的B-ALL患者接受了治疗，治疗3个月内其完全缓解率(completeremission，CR)达81％，6个月无事件生存率和总生存率分别为73％和90％，而12个月无事件生存率和总生存率分别为50％和76％。随后，凯特公司用于复发难治弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuselargeBcelllymphoma，DLBCL)的CAR-T新药Yescarta于2017年10月也获得FDA批准上市，CR率超过50％。上述临床试验结果显示，这种新型疗法恶性血液肿瘤患者带来了极大的生存希望。目前靶向CD19中的CAR-T细胞已被广泛应用于治疗淋巴瘤、骨髓瘤和白血病等血液肿瘤中，也有少量报道用于治疗肝癌、肺癌、乳腺癌等实体肿瘤。CAR-T细胞的应用前景广泛，据不完全统计，目前全球已经有数百种CAR-T细胞在进行临床试验，但是CAR-T细胞治疗所引起的不良反应也逐渐受到人们的关注，常规的不良反应包括：细胞因子释放综合征(CytokineReleaseSyndrome，CRS)，本质是CAR-T细胞识别靶细胞后自身被激活产生大量炎症因子，引起的全身炎症反应，参与CRS的炎症因子包括C反应蛋白、铁蛋白、IFN-γ、IL-1、IL-2Rα、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、GM-CSF、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子受体P55(TNFRP55)、巨噬细胞炎性蛋白1B和可溶性gp130等，CRS临床上则表现为发热、乏力、肌肉酸痛等非特异性症状，严重时可导致患者死亡。免疫效应细胞相关神经毒性综合(ImmuneEffectorCell-associatedNeurotoxicitySyndrome，ICANS)，是指免疫治疗后内源/注入性T细胞和/或其他免疫效应细胞激活或参与导致的，以中枢神经系统病理过程为特征的疾病，与CRS相比，目前ICANS发病机制仍未明确，据推测可能与大脑皮层代谢或血脑屏障改变有关。其他不良反应还包括，外周血细胞减少、B细胞功能缺陷、T细胞恶性转化等等，上述不良反应限制了CAR-T细胞技术的进一步临床应用。为应对上述不良反应，研究人员开展了多方面的尝试，如将CAR-T细胞与其他药物联合使用，优化CAR-T细胞的临床治疗方案，调整给药计划和剂量等，还有人改善嵌合抗原受体的结构，设置自杀系统以便实现可控的CAR-T细胞治疗。其中，对于胞内信号域的改造也受到了研究人员的关注，但是这方面研究较少，且大都处于初步阶段，难以指导如何基于胞内信号域的改变来降低不良反应，如专利文献CN111886242A中公开了CD3ζ多肽缺乏全部或部分的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，有利于提高CAR-T细胞的活化程度，并且指明ITAM1对于CD3ζ的活性至关重要，当其缺失或突变后肿瘤杀伤效果将大为降低，但对于不良反应改善方面未作重点讨论；WO2018183385A1中公开了嵌合受体的信号传导部分包含ITAM的部分，例如半-ITAM，但是并未验证具体技术效果。针对现有技术中的不足，本专利技术提供了一种新型嵌合抗原受体及其应用，包括信号肽、靶向CD19的纳米抗体、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，筛选出了新型高特异性的靶向CD19的单域抗原结合域，并对CD3ζ结构域中的ITAM序列进行了改造和突变，在保留CAR-T细胞足够激活程度的同时，降低免疫因子的释放水平，缓解由于CAR-T细胞治疗而导致的不良反应，为开发新型的肿瘤免疫疗法提供了新思路。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种靶向CD19的新型嵌合抗原受体及其应用，以便提高CAR-T细胞治疗过程中肿瘤杀伤效果，降低不良反应，改善整体临床应用效果本专利技术的详细技术方案如下：提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向CD19的纳米抗体、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述靶向CD19的纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示,胞内信号域为修饰后的CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。CD3ζ胞内信号域源自T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)，TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，TCR的胞质区很短，无法独立传递信号，因此，以非共价形式与CD3形成复合物。每个TCR/CD3复合物，包括1条CD3γ链、1条CD3δ链、2条CD3ε链和2条CD3ζ链，2条CD3ζ链形成二聚体。CD3的胞质区含有多个ITAM(免疫受体酪氨酸激活基序，ImmunoreceptorTyrosine-basedActivationMotif，ITAM)位点，其中γ、δ和ε胞质区分别含有1个ITAM，而ζ链含有3个ITAMs。ITAM是一段约18个氨基酸的比较保守的序列(YXXL/IX6-8YXXL/I)，通常认为序列中的两个酪氨酸(Y)的磷酸化在TCR信号传递中起着不可或缺的作用，CD3分子ITAM序列中酪氨酸的磷酸化后可激活包括PTKs(蛋白酪氨酸激酶，proteintyrosinekinases)途径在内的多种信号通路。通常认为CD3ζ链本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向CD19的单域抗体、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述靶向CD19的单域抗体的互补决定区(CDR区)氨基酸序列依次为：SEQ ID NO:1所示CDR1，SEQ ID NO:2所示CDR2和SEQ ID NO:3所示CDR3，胞内信号域为修饰后的CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、靶向CD19的单域抗体、铰链区、跨膜区、共刺激因子和胞内信号域，所述靶向CD19的单域抗体的互补决定区(CDR区)氨基酸序列依次为：SEQIDNO:1所示CDR1，SEQIDNO:2所示CDR2和SEQIDNO:3所示CDR3，胞内信号域为修饰后的CD3ζ胞内信号域，其氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区为CD28跨膜区，其氨基酸序列如SEQIDNO:6所示，所述铰链区其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，所述共刺激因子选自CD28，其氨基酸序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘欢，杨洋，
申请(专利权)人：北京广未生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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