几丁质脱乙酰酶及其编码基因、重组载体、重组菌株、发酵剂和酶制剂以及它们的应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体涉及几丁质脱乙酰酶及其编码基因、重组载体、重组菌株、发酵剂和酶制剂以及它们的应用。该几丁质脱乙酰酶最适催化温度相对较低(40℃左右)，在较宽的pH范围内(pH值6‑10)均表现出很高的催化活性，工业应用中可以节约能源和辅料等成本，具有广阔的应用前景。优选的重组菌株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Bl22/pMA5‑bli，保藏编号为CGMCCNO.20933。

【技术实现步骤摘要】
几丁质脱乙酰酶及其编码基因、重组载体、重组菌株、发酵剂和酶制剂以及它们的应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种几丁质脱乙酰酶及其编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种发酵剂，一种几丁质脱乙酰酶的制备方法，一种酶制剂，一种脱除几丁质上的乙酰基的方法，以及它们在生产几丁质脱乙酰酶中的应用和它们在脱除几丁质上的乙酰基中的应用。
技术介绍
几丁质(chitin)，又名甲壳质、甲壳素，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体通过β-1，4-糖苷键连接而成的多糖。它是自然界中含量仅次于纤维素的第二大类天然高分子有机化合物，广泛存在于无脊椎动物(如虾、蟹和昆虫等)的外骨骼以及真菌和藻类的细胞壁中。几丁质由于溶解性差，不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂等，大大限制了其利用价值。如几丁质脱去乙酰基(脱乙酰度大于55％)便可得到溶解性极大提高的壳聚糖(chitosan)。而且壳聚糖具有生物降解性、生物相容性、无毒性、抑菌、抗癌、降脂、增强免疫等多种生理功能，可广泛应用于医药、食品、纺织、农业、环保和化妆品等领域，有很高的应用价值和开发前景。目前，壳聚糖的工业生产方法主要为化学法。通常使用40％-60％的浓氢氧化钠高温处理几丁质制备壳聚糖。此法存在生产成本高、环境污染大以及产品稳定性和均一性差等缺点。几丁质脱乙酰酶(chitindeacetylase，E.C.3.5.1.41)可以脱去几丁质上的乙酰基生成脱乙酰度稳定、分子质量分布范围窄的壳聚糖产品。此外，酶法生产壳聚糖，反应条件温和，能耗值低且环境友好，为解决化学法制备壳聚糖存在的问题提供了一条新的途径，是壳聚糖生产行业未来的发展方向。自1974年文献首次报道鲁氏毛霉(Mucorrouxii)几丁质脱乙酰酶后，研究人员已从真菌、细菌和昆虫中分离获得了多种几丁质脱乙酰酶。然而，目前报道的几丁质脱乙酰酶普遍存在发酵时间长，产酶活力低，催化温度高，脱乙酰效果差等问题，且多数为真菌来源的酶，细菌来源的少。细菌在发酵产酶方面较真菌更有优势，菌株更容易实现规模化发酵培养，产酶更容易分离纯化。因此，通过对产几丁质脱乙酰酶微生物资源的开发和基因工程的方法，构建获得高产酶的工程菌株，有望满足酶法制备壳聚糖的工业化生产需要。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种几丁质脱乙酰酶及其编码基因，一种重组载体，一种重组菌株，一种发酵剂，一种几丁质脱乙酰酶的制备方法，一种酶制剂，一种脱除几丁质上的乙酰基的方法，以及它们在生产几丁质脱乙酰酶中的应用和它们在脱除几丁质上的乙酰基中的应用，该几丁质脱乙酰酶能够通过细菌表达，具有催化温度低，适用pH广的优点。为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种几丁质脱乙酰酶，所述几丁质脱乙酰酶为(a)-(e)中任意一项所述的酶：(a)具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列的酶；(b)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有几丁质脱乙酰酶活性的氨基酸序列所示的酶；(c)与SEQIDNO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有几丁质脱乙酰酶活性的氨基酸序列所示的酶；(d)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；(e)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。本专利技术第二方面提供一种编码几丁质脱乙酰酶的基因，该基因具有编码如上所述的几丁质脱乙酰酶的核苷酸序列。本专利技术第三方面提供一种重组载体，所述重组载体含有如上所述的基因。本专利技术第四方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有如上所述的基因或者如上所述的重组载体。优选地，所述重组菌株为地衣芽孢杆菌工程菌株Bl22/pMA5-bli，其保藏编号为CGMCCNO.20933。本专利技术第五方面提供一种发酵剂，所述发酵剂包含如上所述的重组菌株。本专利技术第六方面提供一种几丁质脱乙酰酶的制备方法，该方法包括：将如上所述的重组菌株和/或如上所述的发酵剂接种至发酵培养基中进行发酵，对发酵产物进行分离纯化，得到几丁质脱乙酰酶。本专利技术第七方面提供一种酶制剂，该酶制剂包含如上所述的方法制备得到的几丁质脱乙酰酶。本专利技术第八方面提供一种脱除几丁质上的乙酰基的方法，该方法包括：将如上所述的重组菌株、如上所述的发酵剂、如上所述的方法制备得到的几丁质脱乙酰酶和如上所述的酶制剂中的至少一种与几丁质接触，以对几丁质的乙酰基进行脱除。本专利技术第九方面提供如上所述的几丁质脱乙酰酶、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组菌株、如上所述的发酵剂和如上所述的方法制备得到的几丁质脱乙酰酶中的至少一种在生产几丁质脱乙酰酶中的应用。本专利技术第十方面提供如上所述的几丁质脱乙酰酶、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组菌株、如上所述的发酵剂、如上所述的方法制备得到的几丁质脱乙酰酶和如上所述的酶制剂中的至少一种在脱除几丁质上的乙酰基中的应用。本专利技术所述的几丁质脱乙酰酶的最适催化温度相对较低，为40℃左右，在较宽的pH范围内(pH值6-10)均表现出很高的催化活性，工业应用中可以节约能源和辅料等成本，具有广阔的应用前景。本专利技术的优点还在于在本专利技术所提供的优选重组菌株(地衣芽孢杆菌工程菌株Bl22/pMA5-bli)能够利用普通碳源和氮源快速培养并发酵高产几丁质脱乙酰酶。附图说明图1是几丁质脱乙酰酶编码基因bli琼脂糖凝胶电泳检测结果；图2是几丁质脱乙酰酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果。生物保藏本专利技术提供的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)基因工程菌株，于2020年10月22日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.20933，简称Bl22/pMA5-bli。具体实施方式在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。在本专利技术中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位(U)，本专利技术中酶单位的定义是：在pH7和40℃的条件下，每小时将对硝基乙酰苯胺脱乙酰产生1μg对硝基苯胺的酶量为一个酶活力单位；“酶的比活力”代表每单位质量蛋白质的催化能力，能够反应酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的计算公式为：比活力(U/mg)＝总酶活力单位数/mg总蛋白；单位M表示mol/L。本专利技术第一方面提供一种几丁质脱乙酰酶，所述几丁质脱乙酰本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种几丁质脱乙酰酶，其特征在于，所述几丁质脱乙酰酶为(a)-(e)中任意一项所述的酶：/n(a)具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶；/n(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有几丁质脱乙酰酶活性的氨基酸序列所示的酶；/n(c)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有几丁质脱乙酰酶活性的氨基酸序列所示的酶；/n(d)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；/n(e)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种几丁质脱乙酰酶，其特征在于，所述几丁质脱乙酰酶为(a)-(e)中任意一项所述的酶：
(a)具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列的酶；
(b)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有几丁质脱乙酰酶活性的氨基酸序列所示的酶；
(c)与SEQIDNO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有几丁质脱乙酰酶活性的氨基酸序列所示的酶；
(d)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
(e)在(a)、(b)或(c)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。


2.根据权利要求1所述的几丁质脱乙酰酶，其中，所述几丁质脱乙酰酶为与SEQIDNO：2所示的氨基酸序列具有85％以上，优选90％以上，更优选95％以上，进一步优选98％以上，最优选99％以上同源性，且具有几丁质脱乙酰酶活性的氨基酸序列所示的酶。


3.一种编码几丁质脱乙酰酶的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1或2所述的几丁质脱乙酰酶的核苷酸序列；
优选地，所述基因具有编码具有SEQIDNO.2所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列；
更优选地，所述基因具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。


4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的基因；
优选地，所述重组载体的表达载体为pMA5质粒。


5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求2或3所述的基因或者权利要求4所述的重组载体；
优选地，所述重组菌株选自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的至少一种；
更优选地，所述重组菌株为地衣芽孢杆菌。

【专利技术属性】
技术研发人员：臧传刚，佟毅，张媛，沈雪梅，王小艳，赵国淼，陈博，李义，周勇，卢宗梅，张钊，商谈，
申请(专利权)人：吉林中粮生化有限公司，中粮营养健康研究院有限公司，中粮生物科技股份有限公司，中粮生化能源榆树有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22