一种Aspergillus nidulans几丁质脱乙酰基酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体
本专利技术涉及生物工程
，公开了海洋细菌A.nidulans几丁质脱乙酰基酶的突变体，尤其涉及一种Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体。
技术介绍
几丁质又称甲壳素或甲壳质，广泛存在于虾蟹等甲壳类动物的外骨骼以及藻类和真菌的细胞壁中，是常见的天然有机化合物，由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键连接而成，难溶于水和有机溶剂，其开发应用受到限制，但是几丁质脱去55%以上乙酰基获取的产物为壳聚糖（Chitosan），壳聚糖又称为脱乙酰甲壳素、甲壳胺或可溶性几丁质，是由几丁质经一定程度的脱乙酰过程而生产出来的衍生物，其易溶于水，可进行多种化学修饰，广泛应用于医疗、食品、农业等领域。现有几丁质经脱乙酰产生壳聚糖的处理方法有化学热碱法和生物酶法：化学法存在污染严重、反应过程不易控制、产品分子量不稳定等问题，尤为严重的是排放物造成了巨大的环境污染，严重破坏周边生态破坏，而生物酶法反应温和、不破坏环境，可以制备出高质量的壳聚糖，因此生物酶法制备应用更广泛。几丁质脱乙酰酶（Chitindeacetylase，CDA，E.C.3.2.1.41）是一种糖基水解酶，可以通过催化作用，除去几丁质分子结构中的乙酰基，从而形成壳聚糖。现有对于几丁质脱乙酰酶的研究多从菌种选育、酶的纯化、表达和酶学性质、发酵工艺的改良方面进行研究，上述方法在短时间内可获得较高酶活菌株，但是受到野生菌本身产酶水平的限制，难以筛选获得新颖的催化效率较高的几丁质脱乙酰酶菌株，随着酶工程尤其是定向进化技术的快速发展，为了提高酶的催化效率，本专利技术公开了一种海洋细菌Aspergillusnidulans（A.nidulans）几丁质脱乙酰基酶突变体，旨在通过利用定点突变、定点饱和突变、DNA-shuffling等技术改善酶的催化特性，改变酶的最适催化温度、最适催化pH等条件，同时提高酶的催化效率。
技术实现思路
本专利技术将海洋细菌A.nidulans几丁质脱乙酰基酶进行了突变，相较于突变前，突变体酶的比活力是野生型酶2.95倍，大大提高了几丁质脱乙酰基酶催化效率，更加适合工业化生产需求，其具体方案如下：一种Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体，其特征在于：将真菌Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进行了如下突变：139位亮氨酸（L）突变为甘氨酸（G），164位赖氨酸（K）突变为谷氨酸（E），166位酪氨酸（Y）突变为色氨酸（W），171位丙氨酸（A）突变为色氨酸（W），195位丙氨酸（A）突变为谷氨酸（E），199位组氨酸（H）突变为天冬酰胺（D），所述真菌Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列GenBank收录号为XM_677557.1。进一步的，所述Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶基因密码子优化序列AnCDA如附录1所示。一种如权利要求1所述的Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体的制备方法，其特征在于：通过设计引物对编码几丁质脱乙酰基酶的基因进行定点突变后表达，并将含有编码突变几丁质乙酰基酶的基因的工程菌进行诱导表达，具体包括如下步骤：（1）以Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶基因序列进行密码子优化进而生物合成；（2）构建表达质粒AnCDA-pPICZalphaA；（3）以含有几丁质脱乙酰基酶质粒为模板，设计引物进行突变；（4）将突变后的质粒转化进入E.coliDH5α进行扩增；（5）提取质粒线性化后转化至毕赤酵母X33，选取单克隆转化进行诱导表达获取酶活更高的突变体；（6）将含有编码突变几丁质乙酰基酶的基因的重组毕赤酵母X33进行甲醇诱导表达生产几丁质脱乙酰基酶突变体。进一步的，所述定点突变的引物如下：139primerF:5'CATATATGCGTCCGCCGTATGGAGAAACCAATGAATTAGTTC3'139primerR:5'GAACTAATTCATTGGTTTCTCCATACGGCGGACGCATATATG3'164primerF:5'GCCAGCGTGGATACCGAAGATTATGAAAATC3'164primerR:5'GATTTTCATAATCTTCGGTATCCACGCTGGC3'164primerF:5'CGTGGATACCGAAGATTGGGAAAATCAGGATGCAG3'164primerR:5'CTGCATCCTGATTTTCCCAATCTTCGGTATCCACG3'171primerF:5'GATTGGGAAAATCAGGATTGGGATGCCATTATTAATACC3'171primerR:5'GGTATTAATAATGGCATCCCAATCCTGATTTTCCCAATC3'195primerF:5'CAGGTGGTAATATTGTGCTGGAGCATGATATTCATTATTGGACC3'195primerR:5'GGTCCAATAATGAATATCATGCTCCAGCACAATATTACCACCTG3'199primerF:5'CTGGAGCATGATATTGATTATTGGACCGTGG3'199primerR:5'CCACGGTCCAATAATCAATATCATGCTCCAG3'。进一步的，所述Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶基因密码子优化序列如表附录1所示。进一步的，所述步骤（6）具体操作为：将含有编码突变几丁质脱乙酰基酶的基因的重组菌pPICZalphaA-AnCDA涂布于含有100μg/mL的博来霉素的YPD平板上，至单菌落产生，挑取多个单菌落用引物进行验证，进行诱导表达，挑取异源重组菌接种于20mLBMGY液体培养基，在28℃、200r/min条件下培养至OD600达到2.0-6.0，后以3000r/min离心1min收集菌体，弃上清，再加入50mLBMMY液体培养基重悬，于28℃、200r/min条件下培养，每24h补总体积0.5%的甲醇，诱导7d达到最高表达水平后离心，上清即为AnCDA粗酶液。进一步的，所述BMGY液体培养基组分包括：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，甘油10ml/L，0.1mol/LpH7.0的磷酸钾缓冲液配制，121℃灭菌20min，待冷却，加入10×YNB溶液100mL，500×生物素溶液2mL，在4℃条件下保存。进一步的，所述BMMY液体培养基组分包括：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，0.1mol/L，pH7.0的磷酸钾缓冲液配制，121℃灭菌20min，待冷却，加入10×YNB溶液100mL，500×生物素溶液2mL，过滤除菌的甲醇1mL，在4℃条件下保存。与现有技术相比，本专利技术具有的有益效果如下：本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种

【技术特征摘要】
1.一种Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体，其特征在于：将真菌Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列进行了如下突变：139位亮氨酸（L）突变为甘氨酸（G），164位赖氨酸（K）突变为谷氨酸（E），166位酪氨酸（Y）突变为色氨酸（W），171位丙氨酸（A）突变为色氨酸（W），195位丙氨酸（A）突变为谷氨酸（E），199位组氨酸（H）突变为天冬酰胺（D），所述真菌Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列GenBank收录号为XM_677557.1。


2.根据权利要求1所述的一种Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体，其特征在于：编码Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体的基因。


3.携带权利要求2所述基因的载体pPICZalphaA与E.coliDH5α细胞。


4.一种如权利要求1所述的Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体的制备方法，其特征在于：通过设计引物对编码几丁质脱乙酰基酶的基因进行定点突变后表达，并将含有编码突变几丁质乙酰基酶的基因的工程菌进行诱导表达，具体包括如下步骤：
（1）以Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶基因序列进行密码子优化进而生物合成；
（2）构建表达质粒AnCDA-pPICZalphaA；
（3）以含有几丁质脱乙酰基酶质粒为模板，设计引物进行突变；
（4）将突变后的质粒转化进入E.coliDH5α进行扩增；
（5）提取质粒线性化后转化至毕赤酵母X33，选取单克隆转化进行诱导表达获取酶活更高的突变体；
（6）将含有编码突变几丁质乙酰基酶的基因的重组毕赤酵母X33进行甲醇诱导表达生产几丁质脱乙酰基酶突变体。


5.根据权利要求4所述的一种Aspergillusnidulans几丁质脱乙酰基酶突变体的制备方法，其特征在于：所述定点突变的引物如下：
139primerF:5'CATATATGCGTCCGCCGTATGGAGAAACCAATGAATTAGTTC3'
139primerR:5'GAACTAATTCATTGGTTTCTCCATACGGCGGACGCATATATG3'
164primerF:5'GCCAGCGTGGATACCGAAGATTATGAAAATC3'
164primerR:5'GATTTTCATAATCTTCGGTATCCACGCTGGC3'
164primerF:5'CGTGGATACCGAAGATTGGGAAAATCAGGATGCAG3'
164primerR:5'CTGCATCCTGATTTTCCCAAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘姝，张春光，杭加豪，房耀维，卢静，杨杰，侯晓月，陈佳雨，张弘彧，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32