本发明专利技术公开了一种乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用，通过对现有的N‑乙酰氨基葡萄糖水解酶进行定点突变得到的一种酶活明显提高的N‑乙酰氨基葡萄糖水解酶，所述N‑乙酰氨基葡萄糖水解酶可以高效的水解N‑乙酰氨基葡萄糖，显著提高酶转化过程中氨基葡萄糖的产生效率，从而在提高酶水解法的工业价值的同时还能减少环境污染。
【技术实现步骤摘要】
乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用。
技术介绍
氨基葡萄糖(glucosamine，GlcN)化学式是C6H13O5N，俗称氨基糖，又称氨基葡糖、葡萄糖胺或葡糖胺，简称氨糖，是葡萄糖环2号位的羟基被氨基取代后的产物，在水及亲水性溶剂中溶解度高，主要以氨基葡萄糖盐酸盐(GlucosamineHydrochloride)、氨基葡萄糖硫酸盐(Glucosaminesulfate)和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的形式存在；氨基葡萄糖的天然形式—氨基葡萄糖6-磷酸酯是所有氨基葡糖的生化前体。氨基葡萄糖主要应用在医药、食品和保健品行业，用途广泛。在医药行业中，外源性的补充氨基葡萄糖类化合物有助于人体多形细胞合成氨基多糖与糖蛋白，刺激软骨细胞再生帮助修复受损的软骨组织，阻断关节炎的病理过程、减缓骨关节炎患者疼痛、改善关节功能。此外，氨基葡萄糖还具有免疫调节、抗肿瘤和清除自由基的作用。在食品工业中，由于氨基葡萄糖盐酸盐对在食品工业中常见的细菌、霉菌和酵母菌均有明显的抑制作用，且对人体没有毒害作用，故其作为天然食品防腐剂有很好的市场前景。目前对氨基葡萄糖的生物合成途径研究表明，在微生物中，氨基葡萄糖会强烈抑制合成途径中的关键酶glmS的活性，且若在胞内大量积累对细胞有毒害作用，而N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的性质较稳定，对代谢过程无抑制作用。因此工程菌发酵法生产氨基葡萄糖时，往往将N-乙酰氨基葡萄糖作为发酵目标产物，进而通过胞外脱乙酰水解得到氨基葡萄糖。目前均通过酸水解的方法对N-乙酰氨基葡萄糖进行胞外水解，但这种方法会产生环境污染的问题，酶催化长期以来一直被认为是最绿色的化学合成技术之一，然而目前尚无成熟的N-乙酰氨基葡萄糖酶水解工艺。仅有零星的报导，并且都不是以酶水解工艺的开发为出发点，水解酶的活性也不高。因此挖掘出较高活性的N-乙酰氨基葡萄糖水酶具有重要的工业应用价值和潜力。
技术实现思路
本专利技术提供一种乙酰氨基葡萄糖水解酶突变体及其应用，旨在改善现有的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶活性不高，酶转化过程中生产氨基葡萄糖的效率较低的问题。为改善上述问题，第一方面，本专利技术提供一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶，所述酶的氨基酸序列是对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列的第169位天冬酰胺被丝氨酸取代。在一个实施方式中，所述酶是如下蛋白质：a)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；b)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。其中，如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：与SEQIDNO.2所示氨基酸序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有水解酶活性的蛋白质。第二方面，本专利技术提供了一种核酸分子，所述核酸分子为第一方面中所述N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的编码基因。其中，所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：1)核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的DNA分子；2)与1)限定的DNA序列至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性且编码所述蛋白质的DNA分子；3)利用密码子优化后获得的编码权利要求1所述蛋白质的氨基酸序列及上述1)或2)所述条件的DNA分子。第三方面，本专利技术提供了含有第二方面所述核酸分子的表达载体。其中，所述表达载体可以为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。第四方面，本专利技术提供了含有第三方面所述表达载体或者含有第二方面所述核酸分子的宿主细胞。其中，所述宿主细胞可以选自大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母或黑曲霉；优选为大肠杆菌(Escherichiacoli)。第五方面，本专利技术还提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的制备方法，包括：通过培养第四方面所述的宿主细胞得到所述N-乙酰氨基葡萄糖水解酶。第六方面，本专利技术还提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的制备方法，包括如下步骤：用第一方面所述的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶水解N-乙酰氨基葡萄糖，得到氨基葡萄糖。有益效果：本专利技术提供了一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶，具有水解N-乙酰氨基葡萄糖能力，与现有的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶相比，具有更高的催化活性，可以高效地水解N-乙酰氨基葡萄糖，显著提高酶转化过程中氨基葡萄糖的产生效率，从而在提高酶水解法的工业价值的同时还能减少环境污染。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实施例提供的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶pET-28a(+)-Tk-169S核酸电泳检测结果；图2是本专利技术实施例提供的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶pET-28a(+)-Tk-169S表达的氨基酸测序比对图；图3是本专利技术实施例提供的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的蛋白电泳图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。定义与说明：本专利技术中氨基酸由单字母或三字母代码表示，具有如下含义：A：Ala(丙氨酸)；R：Arg(精氨酸)；N：Asn(天冬酰胺)；D：Asp(天冬氨酸)；C：Cys(半胱氨酸)；Q：Gln(谷氨酰胺)；E：Glu(谷氨酸)；G：Gly(甘氨酸)；H：His(组氨酸)；I：Ile(异亮氨酸)；L：Leu(亮氨酸)；K：Lys(赖氨酸)；M：Met(甲硫氨酸)；F：Phe(苯丙氨酸)；P：Pro(脯氨酸)；S：Ser(丝氨酸)；T：Thr(苏氨酸)；W：Trp(色氨酸)；Y：Tyr(酪氨酸)；V：Val(缬氨酸)。在本专利技术中，关于氨基酸位置或残基的术语“取代”是指在特定位置处的氨基酸已被其他的氨基酸代替。取代可以是保守的或非保守的。本文所用的术语“核酸分子”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，核酸分子可以是包括如SEQIDNO.3所示的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。在本专利技术的具体的实施方式中，所述核酸分子可以是与编码SEQIDNO:2所示氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶，其特征在于，所述酶的氨基酸序列是对应于SEQ IDNO.1的氨基酸序列的第169位天冬酰胺被丝氨酸取代。/n
【技术特征摘要】
1.一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶，其特征在于，所述酶的氨基酸序列是对应于SEQIDNO.1的氨基酸序列的第169位天冬酰胺被丝氨酸取代。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰氨基葡萄糖水解酶，其特征在于，所述酶是如下蛋白质：
a)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列编码的蛋白质；
b)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。
3.根据权利要求2所述一种N-乙酰氨基葡萄糖水解酶，其特征在于，如SEQIDNO.2所示氨基酸序列中第1-270位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质，是指：与SEQIDNO.2所示氨基酸序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性，且具有N-乙酰氨基葡萄糖水解活性的蛋白质。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为权利要求1所述N-乙酰氨基葡萄糖水解酶的编码基因。
【专利技术属性】
技术研发人员：陈振明，贺瑾，王志国，郑晨妮，方亚煊，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。