D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种D‑氨甲酰水解酶突变体及其在D‑芳香族氨基酸合成中的应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术的D‑氨甲酰水解酶突变对多种N‑氨甲酰氨基酸具有较高的活力，可以催化多种脂肪族或芳基取代的氨基酸底物，尤其是空间位阻较大的D‑N‑氨甲酰氨基酸底物。将这些突变体用于海因酶过程级联反应进行催化500mM L‑吲哚甲基海因的验证，其中五突变体A200N/R211G/D187N/S207A/E138W在反应12h时产物得率已经达到81.7％，相比WT(40.1％)，产物得率提升2倍，且反应时间大大缩短，仅需12h。本发明专利技术所获得的D‑氨甲酰水解酶突变体特别适用于海因酶过程级联反应制备光学纯的D‑氨基酸，具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用
本专利技术涉及一种D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用，属于基因工程

技术介绍
D-氨基酸作为一种非天然的氨基酸，常被用来合成各种医药中间体，例如D-对羟基苯甘氨酸常被用来合成头孢菌素的前体(SyldatkC.,AdvancesinBiochemicalEngineeringBiotechnology,1990,29–75)；D-色氨酸(D-Trp)可用于合成奥曲肽Octreotide和他达拉非Cialis，它们是治疗肢端肥大症和勃起功能障碍的重要药物；D-Trp还可用于合成治疗皮炎的肽类药物，包括：TyrocidinesC(D-Phe-Pro-Trp-D-Trp-Asn-Gln-Tyr-Val-Orn-Leu)和Thymodepressin(γ-D-Glu-D-Trp)等(Martínez-Rodríguezetal.,Chem.Biodivers,2010,7,1531–1548)，同时，还可以用作非营养型甜味剂，在食品行业倍受欢迎。D-N-氨甲酰水解酶是属于腈水解酶超家族的第6类，它可以将D-N-氨甲酰氨基酸水解得到的D-氨基酸，常被用来与海因消旋酶和海因酶构成级联反应制备光学纯的D-氨基酸。近年来关于D-芳香族氨基酸的合成研究主要是D-色氨酸和D-对羟基苯甘氨酸，例如，1998年Yamamoto等人，利用D-N-酰胺酶选择性地水解D-色氨酰胺之后通过化学水解得到D-Trp(EP0853128A1)。类似于酰胺酶方法，1957年Greenstein，等人利用L-氨基酰化酶制备D-Trp，其中只有N-乙酰基-DL-色氨酰胺中的L-对映异构体被水解，剩余的对映异构体可通过化学法脱乙酰化形成D-Trp(Greenstein,J.P.,MethodsInEnzymology,1957,3:554–570)。1995年，YamamotoH等人报道可以D-色氨酸酶从DL-Trp外消旋体中降解L-Trp产生D-Trp，但是该反应的副产物丙酮酸和吲哚可抑制色氨酸酶的活性，因而需要去除(Kawasakietal.BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,1995,59:1938–1943)。目前报道的这些方法都存在理论产率为50％，过程复杂，产率低和对映选择性等缺点。尽管在1949年，EadieG等人报道可以由D-氨基酸转氨酶使得底物吲哚丙酮酸和D-丙氨酸反应的方法来制备光学纯D-Trp，该方法理论产率为100％，但是活性低，而最终的产率仅为13％(EadieGetal.JournalofBiologicalChemistry,1949,181:449–458)。海因酶过程是一个由海因消旋酶，海因酶和氨甲酰水解酶组成的三酶级联反应，由于其可以打破传统的50％转化率的限制，因而拥有较高的得率，一直以来被认为是高效经济制备光学纯D-氨基酸的方法。本人在前期的研究中已经筛选到一支来源于成晶节杆菌中的D-氨甲酰水解酶，专利号(201711097767.0)，其能够催化300mML-吲哚甲基海因基本完全转化生成相应的D-色氨酸，该酶用于级联反应虽然可以实现300mM底物的转化，但是需要添加大量的酶(50kU/LAaHyuA,25kU/LAtHyuH,50kU/LAcHyuC)，而且在前期研究中发现由于D-氨甲酰水解酶的酶活力较前两步反应明显偏低，当继续提高底物浓度时，需要进一步加入大量的D-氨甲酰水解酶来完成转化，使得这一过程失去了原有的经济性，因此在前期的研究中，本课题组通过基因挖掘的方法获得了一支来源于印度洋硝酸盐还原菌NitratireductorindicusC115的D-氨甲酰水解酶，命名为NiHyuC,该酶可以实现对1ML-吲哚甲基海因的完全转化，但同样存在着D-氨甲酰水解酶低，酶载量多(50kU/LAaHyuA,25kU/LAtHyuH,50kU/LNiHyuC)的问题。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术通过蛋白质工程改造的方法提高了D-氨甲酰水解酶的催化活性，从而减少酶的添加量，这对于应用海因酶过程高效制备D-氨基酸是至关重要的。本专利技术的第一个目的是提供一种D-氨甲酰水解酶突变体，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第138位点谷氨酸、第187位点天冬氨酸、第200位点丙氨酸、第207位点丝氨酸、第211位精氨酸中的一个或多个位点进行突变。进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第138位点谷氨酸突变为色氨酸(E138W)；或将第187位天冬氨酸替换为天冬酰胺(D187N)；或将第200位丙氨酸替换为丝氨酸(A200S)；或将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺(A200N)；或将第200位丙氨酸替换为谷氨酸(A200E)；或将第207位丝氨酸替换为丙氨酸(S207A)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸(R211G)。进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第138位点谷氨酸突变为色氨酸(E138W/R211G)；或同时将第200位丙氨酸替换为丝氨酸(A200S/R211G)；或同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺(A200N/R211G)；或同时将第200位丙氨酸替换为谷氨酸(A200E/R211G)；或同时将第207位丝氨酸替换为丙氨酸(S207A/R211G)。进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，同时将第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺(R211G/A200N/D187N)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第138位谷氨酸替换为色氨酸，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸(R211G/E138W/S207A)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸(R211G/A200N/S207A)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺(R211G/S207A/D187N)。进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺，第207位点的丝氨酸替换成丙氨酸(R211G/A200N/D187N/S207A)；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺，第138位谷氨酸替换为色氨酸(R211G/A200N/D187N/E138W)。进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第138位点谷氨酸、第187位点天冬氨酸、第200位点丙氨酸、第207位点丝氨酸、第211位精氨酸中的一个或多个位点进行突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第138位点谷氨酸、第187位点天冬氨酸、第200位点丙氨酸、第207位点丝氨酸、第211位精氨酸中的一个或多个位点进行突变。


2.根据权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第138位点谷氨酸突变为色氨酸；或将第187位天冬氨酸替换为天冬酰胺；或将第200位丙氨酸替换为丝氨酸；或将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺；或将第200位丙氨酸替换为谷氨酸；或将第207位丝氨酸替换为丙氨酸；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸。


3.根据权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第138位点谷氨酸突变为色氨酸；或同时将第200位丙氨酸替换为丝氨酸；或同时将第200位丙氨酸替换为天冬酰胺；或同时将第200位丙氨酸替换为谷氨酸；或同时将第207位丝氨酸替换为丙氨酸。


4.根据权利要求1所述的D-氨甲酰水解酶突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的D-氨甲酰水解酶的第211位精氨酸替换为甘氨酸，第200位丙氨酸替换为天冬酰胺，同时将第187位点的天冬氨酸替换成天冬酰胺；或将第211位精氨酸替换为甘氨酸，同时将第138位谷氨酸替换为色氨酸，第207位点的丝...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪晔，刘亚菲，许国超，韩瑞枝，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32