一种酰胺酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酰胺酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术提供了一种酰胺酶及其编码基因，还提供了该酰胺酶的最适pH及其在水解赭曲霉毒素和粮食赭曲霉毒素脱毒中的应用。该酰胺酶在室温条件下，pH 7.3的缓冲体系中处理赭曲霉毒A 2分钟，赭曲霉毒素A的降解率即达到100％，这个降解效率在本领域是前所未有的。

【技术实现步骤摘要】
一种酰胺酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用
本专利技术涉及一种酰胺酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用，属于酶工程

技术介绍
曲霉类真菌毒素主要由黄曲霉、寄生曲霉和赭曲霉等产毒曲霉菌株产生的一类次生代谢产物，已分离鉴定了二十多种结构类似物，其中以黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)毒性最大，在农业生产和食品工业中污染最为广泛。1993年世界卫生组织(WHO)癌症研究机构将黄曲霉毒素划定为Ⅰ类致癌物，将赭曲霉毒素定为ⅡB类致癌物。研究表明，赭曲霉毒素是人类巴尔干肾病的主要病因，因其具有强烈的肾毒性，以及可能的致癌、致畸和致突变性，已逐渐成为公共健康和科研领域关注的焦点。曲霉类真菌毒素污染谷物和油料作物已成为全球性问题，在畜牧业中，曲霉类真菌毒素可通过污染饲料危害动物健康，导致畜牧业生产率低下，造成严重的经济损失，并通过直接或间接(动物产品传播)途径污染食品，影响人类的身体健康。随着人们对曲霉类真菌毒素危害性认识的逐步加深，对于该类真菌毒素检测、污染防控和脱毒技术方面的研究工作也在不断深入，其与人们生活品质、身体健康和经济利益休戚相关。现阶段常采用的赭曲霉毒素A的脱毒方法包括：物理吸附法和化学分解法，能够有效的降低或降解赭曲霉毒素A在食品及饲料中的污染浓度，但是这些脱毒方法通常仍具有很花费昂贵、脱毒难以彻底以及并且它们在处理过程中会引起食品及饲料的感官变化，且导致及其营养成分发生流失的问题变化。生物脱毒因其成本低、安全高效等优势，近年来被认为是去除控制赭曲霉毒素A污染最有前途的方法之一，筛选生物脱毒酶、及其基因，完善脱毒酶的生物学功能，为生物解毒方法积累关键性的核心技术、生物材料及配套技术，将有效更好的促进我国生物脱毒技术的研究。酰胺酶是可以水解酰胺键的酶的统称，广泛的存在于真菌、植物、昆虫和细菌中，自发现以来一直是生物、化学和环境科学领域的研究热点。但是现有的用于降解赭曲霉素的酶的降解效率不高，或不适合工业应用，目前还没有一种赭曲霉毒素降解率高，且适合工业生产的酰胺酶。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种来源于细菌，寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)的酰胺酶，其在原核表达系统中实现了异源高表达，易于后期的纯化和酶制剂的制备，该酶对底物OTA的降解效率极高，其商业化生产成本低。本专利技术的第一个目的是提供一种酰胺酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述的酰胺酶来源于寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)。进一步地，所述的酰胺酶可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本专利技术的肽蛋白可以是糖基化的。本专利技术的第二个目的是提供编码所述酰胺酶的基因。进一步地，所述的基因具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。编码本专利技术所述酰胺酶的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括(但不局限于)：(1)用探针与基因或cDNA文库杂交以检出同源性的多核苷酸序列和(2)表达文库的活性筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段，该表达文库可以包括环境宏基因组文库或某个纯培养菌株所建的克隆文库。本专利技术的DNA片段序列也能用下列方法获得：(1)从基因组DNA分离双链DNA序列；(2)化学合成DNA序列以获得所述酰胺酶的双链DNA。本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组载体。进一步地，所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。本专利技术中，编码酰胺酶的核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本专利技术所述多核苷酸的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本专利技术中适用的载体还包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pcDNA3.1载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体，优选pET载体系列以及其它原核表达载体系列。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码酰胺酶的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA序列、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素等。本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述酰胺酶的重组菌。进一步地，是以细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。本专利技术中，编码酰胺酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。用本专利技术所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的本领域众所周知，可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。通过常规的重组DNA技术，利用本专利技术的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的酰胺酶。一般来说有以下步骤：(1)用本专利技术的编码酰胺酶的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转染合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酰胺酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种酰胺酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种编码权利要求1所述的酰胺酶的基因。


3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.一种携带权利要求2或3所述的基因的重组载体。


5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物...

【专利技术属性】
技术研发人员：周育，陈楠，王旭，杜郑君，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34