幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，特别涉及一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法，本发明专利技术筛选出一种天然的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶蛋白序列，并分别在其蛋白序列N端添加易于透膜的聚阳离子9肽和疏水小太肽，改造后的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因通过大肠杆菌表达体系进行发酵诱导表达，表达量高；进一步提供了无需经过变形和复性的可溶性表达方法，并且纯化步骤简单方便；通过体外实验发现对改造的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶幽门螺旋杆菌标准菌株ATCC700392具有很强的裂解能力，为治疗幽门螺旋杆菌感染的研究提供物质和理论基础。

【技术实现步骤摘要】
幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶及其制备方法。
技术介绍
幽门螺杆菌(helicobacterpylori,HP)感染是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。目前治疗幽门螺杆菌感染以下方案：1)两联疗法：祕制剂与抗生素联用。2)三联或四联疗法：祕剂+甲硝唑+四环素+奥美拉唑；奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素；祕剂+替硝唑+克拉霉素。这些治疗顺应性非常差，且多株HP出现了耐药性，甚至出现了多重耐药菌和超级细菌。因此，当务之急是寻找一种新型抗菌制剂来应对耐药菌的威胁因而，迫切需要新型药物来替代传统疗法，以达到根治幽门螺杆菌的目的。噬菌体(bacteriophage)作为一种细菌病毒，具有特异性高、对人体无副作用等优点被科学家所重视，但是噬菌体作为一个独立的生命体在用作抗菌制剂时会产生抗噬菌体菌株，且生物安全性一直受到质疑。噬菌体裂解酶(bacteriophageendolysins)是dsDNA噬菌体在感染细菌后期表达的一种水解酶。研究者认为噬菌体裂解酶具有以下优点：①特异性强，在杀灭病原菌的同时不会干扰正常菌群。②不易使细菌产生耐药性，由于裂解酶是噬菌体在与细菌共同进化的过程中产生的，针对细菌细胞壁上高度保守的肽聚糖，所以产生耐药性的几率很小。③能杀死在黏膜表面定植病原菌。裂解酶作为一种蛋白质大分子在体内可能会产生相应的抗体中和其杀菌能力，但是一些实验发现其抗体对其没有中和作用。噬菌体裂解酶与噬菌体相比不易产生耐药性，Idelevich等发现嵌合酶PRF-119对噬菌体抗性的金黄色葡萄球菌突变株，目前还没有相关的裂解酶抗性的报告。裂解酶在临床应用的安全性和药代动力学特性的实验正在准备，如裂解酶P128已经进入临床Ⅱ期实验，测试其对人类鼻腔携带的金黄色葡萄球菌的杀菌效力。且裂解酶作为一种蛋白质的理化性质研究已经很成熟，可以对其进行修饰改造，所以噬菌体裂解酶具有新型抗菌制剂的潜力。裂解酶在体内裂解细菌需要借助穴蛋白的穿孔作用，所以裂解酶从外至内裂解细菌时只能作用于没有细胞外膜的革兰阳性细菌。在没有穴蛋白的作用下，革兰阴性细菌细胞外膜能阻挡裂解酶与细菌细胞壁的有效结合，使裂解酶对革兰阴性菌无效。因此，如何在体外直接裂解革兰阴性细菌是裂解酶应用中的一个重大挑战。但最近的一些研究克服了裂解酶这一缺点。Lukacik等对作用于革兰阴性菌的裂解酶的修饰改造做了很多工作，如将鼠疫菌素上能特异识别耶尔森氏菌细胞膜上离子通道的序列与T4裂解酶融合，所得到的重组蛋白能借助离子通道通过耶尔森氏菌的细胞膜，导致耶尔森氏菌的死亡，而且对大肠埃希菌也有明显的杀灭效果。Briers等将铜绿假单胞菌噬菌体裂解OBPgp279和沙门氏菌噬菌体PVP-SE1gp146分别于多种外膜渗透剂(比如polycationicpeptide；hydrophobicpentapeptide；Parasin1，lycotoxin1)组合成融合蛋白“Artilysins”(outermembranepenetratingendolysins)在体外具有较好的裂菌活性。将能够渗透细菌外膜抗菌肽SMAP-29融合在裂解酶KZ144的N端，组合成融合蛋白SMAP-29-KZ144，这些融合蛋白通过大肠埃希菌表达纯化后，能够在其N端外膜渗透剂的帮助下通过细胞膜抵达细胞壁上的肽聚糖靶点，切割肽聚糖链键杀灭革兰阴性菌铜绿假单胞菌，而且沿用这种思路设计的系列抗菌肽裂解酶对铜绿假单胞菌的体内杀灭效果已经在线虫感染模型中得到了证实。目前还没有关于幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶研究的文献或专利；幽门螺旋杆菌是革兰氏阴性菌，其裂解酶可能无法从外到内裂解幽门螺旋杆菌或作用微弱。本领域需要提供一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的蛋白序列以及制备方法，可以实现从外到内裂解幽门螺旋杆菌的改造的噬菌体裂解酶。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供两种改造的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的蛋白序列。本专利技术的另一个目的是提供两种改造的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因在大肠杆菌中可溶性表达和纯化的方法，将该方法制备得到的两种改造的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶应用于体外抑菌试验，研究其对标准幽门螺旋杆菌株的裂解作用。为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：首先，本专利技术提供两种改造的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的蛋白序列：一种为：包含聚阳离子九肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的蛋白序列，其序列结构从N端到C端依次包括A1-A2-A3，核苷酸序列为SeqIDNo.1，氨基酸序列为SeqIDNo.2。另一种为：包含疏水小肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的蛋白序列，其序列结构从N端到C端依次包括A1-B1-A3，核苷酸序列为SeqIDNo.3和氨基酸序列为SeqIDNo.4。A1为肠激酶识别位点VDDDDK。核苷酸序列为SeqIDNo.5，氨基酸序列为SeqIDNo.6。A2为聚阳离子9肽，辅助裂解幽门螺旋杆菌外膜。核苷酸序列为SeqIDNo.,7，氨基酸序列为SeqIDNo.8。A3为天然幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶。核苷酸序列为SeqIDNo.11，密码子优化后的核苷酸序列为SeqIDNo.12，氨基酸序列为SeqIDNo.13。B1为疏水小肽，辅助裂解幽门螺旋杆菌外膜。核苷酸序列为SeqIDNo.9，氨基酸序列为SeqIDNo.10。本专利技术幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因序列是从已报到的幽门螺旋杆菌噬菌体全基因组中分析获得。在Genbank中，具体参见SeqIDNo.11和SeqIDNo.12。本专利技术是采用大肠杆菌为宿主，为了增加宿主的表达效率，本专利技术将改造幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶核苷酸序列进行密码子偏好性优化。在本专利技术优选的实施方式中，编码所述的两种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因序列分别为SeqIDNo.1和SeqIDNo.3所示的核苷酸序列。本专利技术进一步提供一类表达载体，包含编码所述的含两种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因序列。该表达载体属于pSUMO，携带可溶性标签SUMO蛋白。为插入pSUMO中，在合成包含两种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因序列时，两端分别添加了SacI/XhoI酶切位点，序列参见SeqIDNo.1和SeqIDNo.3。再将其插入质粒pSUMO的SacI/XhoI酶切位点。另外，本专利技术提供一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的制备方法，该方法是以大肠杆菌作为表达宿主的可溶性表达方法，包括以下步骤：(1)培养分别包含两种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因的工程菌并诱导两种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的表达；(2)收集菌体；(3)破碎菌体；(4)收集上清；(5)分别纯化上述SUMO-聚阳离子九肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶融合蛋白和SUMO-疏水小肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶融合蛋白；(6)分别酶切上述纯化后的SUMO-聚阳离子九肽幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶融合蛋白和SUMO-疏水小肽幽门螺旋杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含聚阳离子九肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的蛋白序列，其特征在于，核苷酸序列为Seq ID No.1，氨基酸序列为Seq ID No.2。/n

【技术特征摘要】
1.一种包含聚阳离子九肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的蛋白序列，其特征在于，核苷酸序列为SeqIDNo.1，氨基酸序列为SeqIDNo.2。


2.一种包含疏水小肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的蛋白序列，其特征在于，核苷酸序列为SeqIDNo.3，氨基酸序列为SeqIDNo.4。


3.一种可溶型表达载体pSUMO，其特征在于，包含权利要求1所述的核苷酸序列。


4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，包含聚阳离子九肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的基因序列SeqIDNo.1插入质粒pSUMO的SacI/XhoI酶切位。


5.一种可溶型表达载体pSUMO，其特征在于，包含权利要求2所述的核苷酸序列。


6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，包含疏水小肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的基因序列SeqIDNo.2插入质粒pSUMO的SacI/XhoI酶切位。


7.一种包含聚阳离子九肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的工程菌，其特征在于，由将权利要求4所述的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得。


8.一种包含疏水小肽的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的工程菌，其特征在于，由将权利要求6所述的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)而获得。


9.一种幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养权利要求7或8任一所述的幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶工程菌并诱导幽门螺旋杆菌噬菌体裂解酶基因的表达；
(...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅丽，赵珊珊，文可馨，苗森，赵梅，
申请(专利权)人：江苏万邦医药科技有限公司，江苏万邦生化医药集团有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32