拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。本发明专利技术根据毕赤酵母密码子偏爱性，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示，利用全基因合成方法获得拟盘多毛孢属真菌的几丁质脱乙酰酶编码基因序列。进一步利用毕赤酵母表达系统对所述优化的几丁质脱乙酰酶编码基因进行分泌表达，获得几丁质脱乙酰酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术获得的几丁质脱乙酰酶可对几丁质、壳聚糖及壳寡糖中的乙酰基进行脱除，从而获得特定结构的壳聚糖或壳寡糖。这些特定结构的壳聚糖或壳寡糖可具有新的或更高的生物活性。因此，该拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其脱乙酰产物均具有良好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】
拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用
本专利技术属于壳聚糖或壳寡糖制备
，具体涉及一种拟盘多毛孢属真菌(Pestalotiopsissp.)几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用。
技术介绍
壳聚糖具有抗菌及激发动植物免疫等一系列生物活性。目前，主要通过化学法使用强碱对几丁质进行化学脱乙酰获得，容易造成环境污染。直接使用几丁质脱乙酰酶对几丁质进行脱乙酰有可能获得乙酰基位点分布可控的壳聚糖，且对环境友好。壳寡糖是甲壳素或者其脱乙酰产物壳聚糖经物理、化学或酶学等方法降解产生的寡聚物，由氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)、N-乙酰氨基葡萄糖(N-Acetylglucosamine，GlcNAc)或者二者的组合通过β-1,4糖苷键连接而成，通常聚合度(degreeofpolymerization，DP)<20。壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性。研究发现，壳寡糖生物活性的发挥与其结构，如DP及脱乙酰度(Degreeofdeacetylation,DDA)甚至乙酰基在寡糖链上的分布等密切相关。因此，制备结构可控的壳寡糖是该领域多功能及高活性新产品研发的新方向。利用不同底物识别类型的几丁质脱乙酰酶对几丁质、壳聚糖或壳寡糖进行脱乙酰，可以获得特定脱乙酰度及乙酰基位点分布的壳聚糖或壳寡糖，从而得到可能具有更高或更新生物活性的新产品。目前，尚缺乏工业用的几丁质脱乙酰酶制剂，限制了该领域的发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶及其制备方法和应用，旨在提供一种经济高效的几丁质脱乙酰酶。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自以下其中一种：(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(2)对SEQIDNO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；(3)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。作为优选实施方案，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；更优选地，具有95％以上的同源性。作为优选实施方案，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有98％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；更优选地，具有99％以上的同源性。本专利技术还提供一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因，其编码上述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶。作为优选实施方案，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因。作为优选实施方案，所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：将表达载体pPIC9中如SEQIDNO.4所示的信号肽序列进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的信号肽序列如SEQIDNO.5所示；利用NsiI/XhoI双酶切，将表达载体pPIC9中如SEQIDNO.4所示的序列替换为如SEQIDNO.5所示的信号肽序列，得到表达载体pGBG1。本专利技术还提供所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的制备方法，该方法为：将上述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的几丁质脱乙酰酶。作为优选实施方案，所述毕赤酵母为GS115。作为优选实施方案，所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的制备方法包括如下步骤：(1)将核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶壳聚糖酶基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；(2)对前述构建的表达载体pGBG1进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有几丁质脱乙酰酶基因的片段；(3)将获得的含有几丁质脱乙酰酶基因的表达载体导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导培养，获得分泌表达的几丁质脱乙酰酶。本专利技术还提供了所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶在几丁质、壳聚糖或壳寡糖脱乙酰中的应用。所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶还可与其他酶类，如几丁质脱乙酰酶、几丁质酶或壳聚糖酶等混合使用，协同制备特定结构壳聚糖或壳寡糖。利用诱导表达的粗酶上清对壳聚糖或壳寡糖底物进行水解并使用质谱方法对产物的组成进行分析。结果表明，本专利技术所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶可用于壳聚糖或壳寡糖的脱乙酰。这些经脱乙酰后的壳聚糖或壳寡糖与调控前相比，可具有新的或更高的生物活性。因此，该酶及其脱乙酰产物均具有良好的工业应用前景。其中，表达载体pPIC9和毕赤酵母细胞GS115均为商业化产品。在本专利技术的研发过程中，专利技术人对多种细菌及真菌来源的几丁质脱乙酰酶进行了序列优化并试图在毕赤酵母中进行分泌表达，真菌包括构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的五个脱乙酰酶基因(氨基酸序列号：XP_659456.1，ACF22099.1，XP_660066.1，XP_662427，XP_657764)；细菌包括根瘤菌属细菌(Rhizobiumsp.GRH2)脱乙酰酶NodB(氨基酸序列号：AJW76244.1)；以及霍乱弧菌(VibriocholeraeO1biovarElTorstr.N16961)脱乙酰酶VcCDA(氨基酸序列号：AAF94439.1)；但是这些优化后的几丁质脱乙酰酶基因均未能够在毕赤酵母中成功表达。经过大量实验探索发现拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶成功在毕赤酵母中实现分泌表达。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1.本专利技术的几丁质脱乙酰酶基因来源于拟盘多毛孢属真菌，使用巴斯德毕赤酵母表达系统分泌表达。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统也已被用于乳糖酶及磷脂酶C等食品级酶制剂的表达，其自身也被用于木聚糖酶的生产(GB2760-2014)。因此，使用拟盘多毛孢属真菌来源的几丁质脱乙酰酶基因在毕赤酵母中分泌表达，其产物几丁质脱乙酰酶可用于壳聚糖或壳寡糖的生产。2.目前尚无商品化的几丁质脱乙酰酶，本专利技术可能填补该项空白，在新结构壳聚糖及壳寡糖制备领域取得较广泛应用。附图说明图1为本专利技术实施例2中的重组表达载体pescda-pGBG1及其酶切产物凝胶电泳图谱。图2为本专利技术实施例3中含拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因的毕赤酵母工程菌发酵液上清的SDS-PAGE图谱。图3为本专利技术实施例4中低脱乙酰度壳寡糖(几丁寡糖，NACOS)的质谱图。图4为本专利技术实施例4中低脱乙酰度壳寡糖(几丁寡糖，NACOS)经几丁质脱乙酰酶Pescda水解后获得产物的质谱图。图5为本专利技术实施例5中低脱乙酰度壳聚糖(DA70本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶，其特征在于：所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自以下其中一种：/n(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；/n(2)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；/n(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶，其特征在于：所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自以下其中一种：
(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(2)对SEQIDNO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；
(3)与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶，其特征在于：所述拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶的氨基酸序列选自与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列；更优选地，具有95％以上的同源性。


3.一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶。


4.如权利要求3所述的一种拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


5.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含权利要求3或4所述的拟盘多毛孢属真菌几丁质脱乙酰酶基因。


6.如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：所述表达载体为pGBG1，表达载体pGBG1通过如下方式获得：
将表达载体pPIC9中如SEQI...

【专利技术属性】
技术研发人员：任立世，冯翠，张毓宸，焦思明，王颖，程功，孙明，杜昱光，
申请(专利权)人：中科荣信苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32