FAAH假基因的基因疗法制造技术

本发明专利技术涉及通过使用脂肪酸酰胺水解酶假基因(FAAH‑OUT)抑制剂来减轻疼痛的镇痛治疗。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】FAAH假基因的基因疗法
本专利技术涉及减轻疼痛的镇痛治疗。
技术介绍
脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)是包括N-酰基乙醇胺(例如花生四烯乙醇胺(AEA)、棕榈酰乙醇胺(PEA)和油酰乙醇胺(OEA))和N-酰基牛磺酸在内的多种生物活性脂质的主要分解代谢酶1,2。已显示大麻素受体的内源性配体(即内源性大麻素)花生四烯乙醇胺在伤害性感受、恐惧消退记忆、焦虑和抑郁中起作用3,4。在Faah敲除小鼠中，花生四烯乙醇胺的脑组织水平显著提高，响应急性热刺激而显示出镇痛表型，并在福尔马林和角叉菜胶炎症模型中表现出疼痛减轻5,6。人FAAH基因含有通常携带的显著降低FAAH酶活性的亚等位基因SNP(C385A；rs324420)7。遗传关联性研究已经探究了该SNP和其他FAAHSNP与疼痛敏感性之间的联系8-10。值得注意的是，在接受乳腺癌手术的一群女性中，亚等位基因SNP的纯合子携带者表明具有明显较低的冷痛敏感性，并且术后镇痛的需求较少8。此外，人SNP小鼠敲入模型显示，小鼠和人SNP携带者均表现出恐惧消退学习增强，并且焦虑相关行为减少11。因此，尽管FAAH是引人注目的用于治疗疼痛、以及焦虑和抑郁的药物靶标，但是最近用FAAH抑制剂进行的临床试验已证明是不成功的12,13。本专利技术描述了使用基因疗法抑制FAAH功能的途径，其预期不会产生小分子FAAH拮抗剂的副作用问题。
技术实现思路
专利技术人已经发现了脂肪酸酰胺水解酶假基因(FAAH-OUT)中的微缺失与个体感受疼痛的能力之间的联系。特别地，通过研究具有痛觉减退表型的个体(PFS)，本专利技术人在该个体中鉴定了FAAH-OUT的微缺失，所述FAAH-OUT的微缺失在正常疼痛表型的个体中并不存在。微缺失破坏了全长FAAH-OUT转录本的正常表达(例如导致FAAH-OUT表达更低或更高)，其结果是FAAH功能减弱，内源性镇痛分子(例如花生四烯乙醇胺)水平提高。也可以使用基因疗法直接破坏FAAH基因。本专利技术提供了减轻疼痛的镇痛治疗的方法，该方法包括将有效量的脂肪酸酰胺水解酶假基因(FAAH-OUT)抑制剂给药至遭受疼痛的个体。本专利技术还提供了用于治疗疼痛的方法中的FAAH-OUT抑制剂，该方法包括将有效量的所述抑制剂给药至对象。本专利技术还提供了减轻疼痛的镇痛治疗的方法，该方法包括将有效量的脂肪酸酰胺水解酶基因(FAAH)抑制剂给药至遭受疼痛的个体，其中该抑制剂是针对FAAH的单链或双链DNA或RNA分子。本专利技术还提供了用于治疗疼痛的方法中的FAAH抑制剂，该方法包括将有效量的所述抑制剂给药至对象。附图说明图1：(A)显示PFS中的FAAH、FAAH-OUT和微缺失的基因组图谱。人染色体1显示FAAH和FAAH-OUT的基因足迹(genefootprints)。外显子用黑框指示，转录方向用箭头显示。FAAHSNPrs324420映射至第3外显子(由星号显示)。显示在PFS中检测到8,131bp微缺失，该微缺失的两侧是Alu重复序列(灰色框)。FAAH-OUT的启动子区域以及外显子1和2映射到缺失的序列中。(B)实时RT-qPCR显示FAAH-OUT在人组织中的表达谱。FAAH-OUT在广泛的人体组织中，尤其是在背根神经节(DRG)和数个大脑区域中表达。显示相对于β肌动蛋白的表达。图2：FAAH和FAAH-OUTRNA不同地定位在人DRG切片中。FAAH和FAAH-OUTRNA表达通过RNA的荧光原位杂交(技术)来检测。用针对FAAH和FAAH-OUT的探针分析5μm厚的FFPE固定的人DRG切片。对于细胞核，用DAPI染色作为对照。显示FAAH-OUT(单尾箭头)和FAAH表达(双尾箭头)的示例。(A)人DRG节的整体图像显示，在神经元细胞质中容易检测到FAAHRNA，而FAAH-OUTRNA则定位在核中。(B)和(C)分别显示在主视图(A)中概示的区域B和C，以提供表达FAAH和FAAH-OUT的神经元的较近视图。图3：在PFS中AEA、PEA和OEA循环水平显著增加。通过质谱法测量取自PFS和4个不相关正常对照的血液样品中的AEA、PEA、OEA和2-AG的水平。AEA、PEA和OEA是FAAH的底物；2-AG则不是。对照A和B是亚等位基因SNP的纯合WT，对照C和D是杂合携带者。4个对照的平均值为AEA(1.15pmol/ml)，PEA(43.4pmol/ml)，OEA(5.06pmol/ml)和2-AG(42.2pmol/ml)，这与之前使用相似测量方案得到的数据一致14。PFS(2个读数)的平均值是AEA(1.99pmol/ml)、PEA(113.07pmol/ml)、OEA(17.26pmol/ml)和2-AG(45pmol/ml)。图4：患者PFS中的定量感觉测试。根据德国神经性疼痛研究网络的方案进行了定量感觉测试(QST)。QST是对给定刺激的感觉感知的测量。该测试可以显示感觉功能异常，但不能将异常定位在神经系统的特定结构上。针对每个评估部位，对高加索人对照群进行评估部位的比较。感觉功能的获得表示为z分数>2，感觉功能的丧失表示为<2。对照部位：手部，试验部位：足部。该测试揭示了手部和足部在温检测阈值和热感觉阈限中的病理性低敏感性，以及对于热痛阈值的一些足部低敏感性。足部的机械检测阈值异常。没有证据表明存在反常热感(paradoxicalheatsensation)和/或动态机械触诱发痛。CDT，冷检测阈值；WDT，温检测阈值；TSL，热感觉阈限；CPT，冷痛阈值；HPT，热痛阈值；PPT，压痛阈值；MPT，机械痛阈值；MPS，机械痛敏感性；WUR，收缩率(windupratio)；MDT，机械检测阈值；VDT，振动检测阈值；DMA，动态机械触诱发痛；PHS，反常热感。图5：使用CytoscanHD阵列对微缺失进行的鉴定。ChromosomeAnalysisSuite(Affymetrix)截图显示在PFS的1号染色体上鉴定出的杂合的约8kb微缺失。八个连续的探针(沿-1虚线用点指示)显示-1等位基因拷贝数并跨越染色体1p33:46,882,936-46,890,857(版本hg19)。在分析时，该微缺失(实心矩形)未在基因组变体数据库中标注(参见图中的基因组变体数据库(DGV)中的空白痕迹)。随后，在千人基因组计划(1000GenomesProject)的第3阶段报道了5008个等位基因中有1个类似的缺失(该个体HG10353是FAAHSNPrs324420的纯合野生型)。微缺失位于FAAH3'UTR的下游约4.7kb。图底部的FAAH基因旁边显示未标注的外显子。随后，我们使用5'RACE将这一新的基因足迹扩展到了微缺失区域。图6：验证PFS中的微缺失。(A)定位在微缺失区域外部的PCR引物从PFS和她的儿子(即包含微缺失的等位基因)中扩增出2,259bp的区域，如白色箭头所示。来自相同反应的野生型等位基因产物为10,390bp(超出了DNA聚合酶的能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种减轻疼痛的镇痛治疗的方法，所述方法包括将有效量的脂肪酸酰胺水解酶假基因(FAAH-OUT)抑制剂给药至遭受疼痛的个体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180213 GB 1802326.71.一种减轻疼痛的镇痛治疗的方法，所述方法包括将有效量的脂肪酸酰胺水解酶假基因(FAAH-OUT)抑制剂给药至遭受疼痛的个体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑制剂抑制FAAH-OUT基因表达。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述抑制剂抑制FAAH-OUT的转录或降低FAAH-OUT的作用以实现镇痛作用。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂的给药导致个体中N-酰基乙醇胺水平提高，任选地，其中所述N-酰基乙醇胺选自花生四烯乙醇胺(AEA)、棕榈酰乙醇胺(PEA)和油酰乙醇胺(OEA)中的至少一种。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂修饰编码FAAH-OUT的DNA序列。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述修饰通过基因编辑进行。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是包含引导序列的引导RNA，所述引导序列与FAAH-OUT的位点杂交并且使CRISPR-Cas酶靶向FAAH-OUT。


8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引导序列使所述CRISPR-Cas酶靶向FAAH-OUT的调节区。


9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引导序列使所述CRISPR-Cas酶靶向FAAH-OUT的启动子。


10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是针对FAAH-OUT的单链或双链DNA或RNA分子。


11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂靶向编码具有SEQIDNO:5的FAAH-OUT基因的序列或所述FAAH-OUT基因的表达产物。


12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂通过鞘内给药。


13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抑制剂使用腺相关载体(AAV)进行递送。


14.一种用于治疗疼痛的方法中的用途的FAAH-OUT抑制剂，所述方法包括将有效量的所述抑制剂给药至对象。


15.根据权利要求14所述的用于用途的FAAH-OUT抑制剂，其特征在于，所述抑制剂抑制FAAH-OUT基因表达。


16.根据权利要求14或15所述的用于用途的FAAH-OUT抑制剂，其特征在于，所述抑制剂抑制FAAH-OUT转录或降低FAAH-OUT的作用以实现镇痛作用。

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【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·约翰·考克斯，德吉特·斯里瓦斯塔娃，
申请(专利权)人：UCL商业有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB