一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用。本发明专利技术通过提取克劳氏芽孢杆菌基因组DNA，经PCR扩增得到野生型碱性蛋白酶基因序列，将扩增得到的野生型碱性蛋白酶基因通过易错PCR进行随机突变，通过高通量筛选后获得了若干个高活力碱性蛋白酶基因，再将这些高活力碱性蛋白酶基因进行DNA改组，通过筛选后获得八个更高活力的碱性蛋白酶突变体基因。将这八个突变体基因构建重组载体并在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型碱性蛋白酶。

【技术实现步骤摘要】
一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用
：本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用。技术背景：蛋白酶是催化蛋白肽键裂解，可将蛋白分子、多肽降解为小的肽链、氨基酸的一类水解酶，根据蛋白酶作用时适宜pH值的不同，可分为中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的最适反应pH值一般大于9，较其它蛋白酶而言，碱性蛋白酶的酶活力、耐热、耐碱能力更强，并且具有酯酶特性。这些优势使得碱性蛋白酶在工业上的应用更为广泛，其在洗涤剂、食品加工、饲料、环境保护、皮革制造和丝绸制造等行业都有着十分重要的作用。在洗涤剂中加入碱性蛋白酶能保持被洗衣物的原有色彩，提高产品的去污效果，有效减少洗涤剂中表面活性剂和某些助剂的用量，还能增加节水、节能和环境保护的效益。在食品中主要用来水解植物蛋白质，植物蛋白水解后转化成分子量更小的肽和氨基酸，更利于消化吸收，产品营养价值更高，产品质量和安全性也相对更好。在制革工艺中以蛋白质和蛋白质类似物为主要成分的皮与毛，通常情况下处理较为困难，传统的方法是利用有毒的化学物质进行处理，这种方法不但危害人们自身安全，而且对环境也有着很大的污染，而蛋白酶可以代替这些化学物质来降解制革过程中非胶质组分和非纤维蛋白，同时也可以减少环境的污染。微生物是蛋白酶的重要来源，相比于植物蛋白酶和动物蛋白酶，微生物由于其生长迅速、易于人工遗传改造，产生的蛋白酶类资源丰富微生物可以在相对较短的时间内大量培养，因此可以生产大量的满足生产需要的酶类。产碱性蛋白酶的微生物主要从盐碱湖、深海、沙地等碱性环境中分离得到，目前，芽孢杆菌、放线菌以及真菌均有报道可以产碱性蛋白酶，但在工业生产中主要是芽孢杆菌属。然而，由于菌株自身产酶能力有限，导致了发酵酶活水平不高，芽孢杆菌产碱性蛋白酶的产品成本较高，限制了其大规模的应用。因此，提高碱性蛋白酶活力对其在工业生产及应用具有重要的意义。蛋白质工程是建立在基因工程基础上的新技术，主要依靠计算机软件等辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对蛋白编码基因的人工定向改造，对蛋白质进行修饰、改造和拼接以获得能满足人类需要的新型蛋白质的技术。酶的定向进化又称为酶的体外分子定向进化，属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程新的发展方向，它不用事先了解蛋白质的结构、活性位点、催化机制等因素，而是模拟自然进化过程，人为地创造特殊的进化条件，从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得的酶前体)出发，在体外或体内对基因进行随机突变或体外基因重组，构建人工突变酶库，进一步通过一定的筛选或选择方法，最终获得预先所期望的具有某些特性的进化酶。体外定向进化常用方法主要是易错PCR(Error-pronePCR)和DNA改组(DNAshuffling)。易错PCR是通过利用低保真度TaqDNA聚合酶和改变PCR反应条件，如加入Mn、改变循环次数和dNTP浓度等，降低DNA复制的保真度，在新DNA链合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导DNA序列变异的方法。DNA改组是将一个或一组密切相关的基因序列，在DNaseI作用下切割成一系列随机大小的DNA小片段，由于基因的同源性，这些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它们通过自身引导，随机重组，最后通过特定引物的PCR，生成全长基因，在这一过程中，由于模板的变换产生了相关序列间的交换，从而产生了多样的基因重组文库，再进一步对改组的基因表达的产物进行筛选，从而达到目的基因的定向进化。芽孢杆菌表达系统具有以下优点：1、芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽和分子伴侣系统，这有利于实现目的蛋白的高效表达；2、大多数芽孢杆菌都是没有致病性的，这符合工业生产中的一般安全需求；3、芽孢杆菌的细胞壁组成要相对简单，这有利于表达蛋白的胞外分泌，不会导致分泌蛋白在细胞内积累，有利于蛋白的下游回收和纯化；4、芽孢杆菌作为单细胞生物，可以较短时间内达到较高的菌体密度，且所需培养基组成相对较简单，成本较低符合工业生产的要求。因此，本专利技术中，基于碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达平台，利用易错PCR及DNA改组技术，对来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因进行分子改造，获得高活力碱性蛋白酶基因，并成功在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌体系中进行表达。
技术实现思路
：本专利技术目的在于提供一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用。本专利技术为实现上述目的提供的技术方案之一为：以克劳氏芽孢杆菌CGMCCNO.12953基因组为模板，克隆出野生型碱性蛋白酶酶原区基因apr(SEQIDNO.3所示)序列后(氨基酸序列如SEQIDNO.4所示)，通过连续易错PCR对野生型碱性蛋白酶基因进行随机突变，再利用枯草芽孢杆菌表达系统进行高通量筛选获得若干碱性蛋白酶高活力突变体基因，再将这些高活力碱性蛋白酶突变体基因进行DNA改组，经过筛选后获得高活力的碱性蛋白酶突变体基因。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案之二为：将上述突变体基因构建重组载体并在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型碱性蛋白酶，可应用在洗涤剂、食品、制革、医药等领域。在本专利技术中采用如下定义：1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，采用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2、碱性蛋白酶高活力突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶高活力突变体中突变的氨基酸。在本专利技术中，碱性蛋白酶的突变点位置按其成熟肽的氨基酸序列进行编号，位置的编号对应于SEQIDNO.6中野生型碱性蛋白酶成熟肽的氨基酸序列编号，如Asn212表示野生型碱性蛋白酶成熟肽氨基酸序列的第212位氨基酸为Asn，Asn212Ser表示位置212的氨基酸由野生型碱性蛋白酶的Asn替换成Ser，也可用氨基酸单字母简称进行表示，如N212S，同时发生多位点突变的采用“/”连接各突变位点的方式表示，如V11I/G95V/V145I/N212S，表示位置11、95、145和212位的氨基酸依次由野生型碱性蛋白酶的V替换成I、由G替换为V、由V替换为I、由N替换为S；核苷酸表示方法与氨基酸表示方法类似，位置的编号对应于SEQIDNO.5中野生型碱性蛋白酶的核苷酸序列编号，如C425，表示碱性蛋白酶核苷酸序列的第425位碱基为C。在本专利技术中，APR表示野生型碱性蛋白酶，即原始序列如SEQIDNO.4所示，其编码基因表示为apr(如SEQIDNO.3所示)。用APRM加数字X的方式表示各个碱性蛋白酶突变体，各突变体的编码基因则以其氨基酸表示形式的小写斜体表示。本专利技术中，所述碱性蛋白酶突变体具有蛋白水解活性，其成熟肽是：(1)在SEQIDNO.6所示的野生型碱性蛋白酶成熟肽基础上发生包含以下突变中的任意一种获得的：V11I/G23A/G25P/I35V/G95P/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶的成熟肽是：/n(1)在SEQ ID NO.6所示的碱性蛋白酶酶原区序列的基础上，发生包含以下突变组合中的任意一种获得的：/nV11I/G23A/G25P/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267G、/nV11L/G23A/G25P/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267G、/nV11L/G23A/G25A/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267G、/nV11I/G23A/G25A/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267G、/nV11I/G23A/G25A/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267P、/nV11L/G23A/G25A/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267P、/nV11I/G23A/G25P/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267P、/n或V11L/G23A/G25P/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267P；或者/n(2)与(1)同源性75％以上的氨基酸序列；或者/n(3)在(1)的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有(1)相同功能的氨基酸序列。/n...

【技术特征摘要】
1.一种碱性蛋白酶突变体，其特征在于，所述碱性蛋白酶的成熟肽是：
(1)在SEQIDNO.6所示的碱性蛋白酶酶原区序列的基础上，发生包含以下突变组合中的任意一种获得的：
V11I/G23A/G25P/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267G、
V11L/G23A/G25P/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267G、
V11L/G23A/G25A/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267G、
V11I/G23A/G25A/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267G、
V11I/G23A/G25A/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267P、
V11L/G23A/G25A/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267P、
V11I/G23A/G25P/I35V/G95P/S99H/V145I/N212S/A267P、
或V11L/G23A/G25P/I35V/G95P/S99H/...

【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，刘逸寒，李玉，张元夫，王兴吉，王克芬，刘文龙，刘夫锋，张会图，
申请(专利权)人：天津科技大学，山东隆科特酶制剂有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12