一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术采用全质粒PCR对携带角蛋白酶基因的质粒进行定点饱和突变，构建筛选得到热稳定性突变重组菌，得到角蛋白酶突变体T78C和T78E。热稳定性研究结果显示角蛋白酶突变体T78C和T78E在60℃的半衰期为亲本酶的2.25倍和2.1倍。

【技术实现步骤摘要】
一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体
本专利技术涉及一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体，属于基因工程和工程

技术介绍
角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如羽毛，羊毛，牛羊角等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物产生。角蛋白酶作为一种底物专一性较宽泛，水解催化能力强的蛋白酶，广泛地运用于畜牧行业、饲料行业、制革行业、医药行业中，具有巨大的研究与应用价值。但是，野生角蛋白酶的酶活及热稳定性普遍较差。在工业化应用上对酶的要求苛刻，如高温环境会很大程度影响角蛋白酶的酶活。在实际应用中通常需要加热来加速反应，提高了能耗，且角蛋白酶粉制备时的喷雾干燥过程也需要加热。因此，热稳定的角蛋白酶在实际应用中非常重要。目前，提高酶热稳定性的方法主要包括固定化、化学修饰、补充添加剂、酶的转译后修饰和蛋白质工程等方法。虽然前两种策略可以提高酶的热稳定性，但是需要附加工艺对酶进行处理，增加了生产成本。因此，应用蛋白质工程的手段从分子水平提高酶的热稳定性将是一个新的研究手段。随着绿色产业的推动，迫切需要角蛋白酶产业化的实现，但目前角蛋白酶的热稳定性总体仍未达到商业化应用的需求。课题组前期已经构建获得一株具有高角蛋白水解酶活的角蛋白酶重组菌，其在15L发酵罐上角蛋白酶活力达到426.60KU/mL以上(该角蛋白酶记载于Biotransformationofkeratinwastetoaminoacidsandactivepeptidesbasedoncell-freecatalysis文献中)，是目前文献已报道的重组角蛋白酶表达的最高水平。但是该角蛋白酶的热稳定性不高，所以为了进一步提高酶的应用性能，有必要进一步提高上述角蛋白酶的热稳定性。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了角蛋白酶突变体，采用定点饱和突变策略，对亲本酶的氨基酸位点进行突变改造，以提高角蛋白酶的热稳定性。本专利技术提供了角蛋白酶突变体，所述角蛋白酶突变体是以氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的角蛋白酶为亲本，对亲本角蛋白酶的第78位进行突变。在本专利技术的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为半胱氨酸得到突变体T78C，所述突变体T78C氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为谷氨酸得到突变体T78E，所述突变体T78E氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术还提供了一种编码所述的角蛋白酶突变体的基因。本专利技术还提供了一种携带编码所述突变体酶的述基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pP43NMK质粒。本专利技术还提供了携带编码所述突变体酶的基因或所述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组细胞的构建方法为将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。本专利技术提供一种降解角蛋白酶的方法，所述方法为以鸡羽毛为底物，加入突变体T78C和/或T78E，进行反应。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为以含角蛋白的物质为底物，加入纯化后的突变体T78C和/或T78E，在37℃反应4h。在本专利技术的一种实施方式中，所述含角蛋白的物质包括皮毛、弹性蛋白、鳞片、纤维。在本专利技术的一种实施方式中，所述含角蛋白的物质包括皮肤、酪蛋白、毛料、指甲、羽毛。本专利技术提供了一种所述突变体、基因、表达载体或宿主细胞在畜牧业、饲料业、制革业、医药业中的应用。本专利技术还要求保护所述突变体、基因、表达载体或宿主细胞在降解皮肤、毛发、酪蛋白、弹性蛋白、毛料、指甲、鳞片、纤维、毛发角蛋白中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术采用全质粒PCR构建得到角蛋白酶突变体T78C、T78E，热稳定性研究结果显示角蛋白酶突变体T78C和T78E在60℃的半衰期均为亲本酶的2.25倍和2.1倍，更具有应用价值与潜力。附图说明图1为角蛋白酶突变体T78C，T78E的枯草芽孢杆菌上清SDS-PAGE凝胶电泳；其中，M代表蛋白分子量标准，不同泳道代表不同的突变蛋白，箭头指示目的蛋白条带位置。图2为不同突变体与对照菌在60℃热稳定性比较。图3为突变体降解羽毛图；a为0h的反应体系；b为4h后的反应体系。具体实施方式下述实施例中涉及的大肠杆菌JM109购自北纳生物；下述实施例中涉及的pP43NMK质粒购自丰晖生物；下述实施例中涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WB600记载于公开号为CN102492645A的专利申请文本中。(一)实施例中涉及的培养基为：LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl10.0g·L-1。LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl10.0g·L-1、琼脂粉15g/L。发酵培养基：蛋白胨20g·L-1、酵母粉10g·L-1、蔗糖20g·L-1、KH2PO43g·L-1、Na2HPO46g·L-1、MgSO40.3g·L-1。(二)实施例中涉及的检测方法如下：角蛋白酶酶活的测定：取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL50mM的Gly/NaOH溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的水溶性角蛋白(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，产品编码：K0043)作为底物，混匀后于40℃下反应20min；加入200μL4％(w/v)的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温8000r/min离心3min。取上清200μL，加入1mL4％(w/v)的Na2CO3和200μL的福林酚试剂，混匀后50℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上；酶活的定义：在该条件下OD660每升高0.001所需酶量为一个酶活力单位(1U)。酶的纯化：采用AKTAavant蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化。由于不同角蛋白酶突变体都含有组氨酸标签，所以可以镍离子亲和层析纯化柱进行分离纯化，具体步骤如下：(1)平衡：用5倍体积的20mmol/LpH7.4Tris-HCl缓冲液平衡纯化柱；(2)上样：预先处理好的样品以0.5ml/min的流速上样，上样体积一般不超过柱体积的5倍；(3)洗脱：包括洗脱未吸附物质、杂蛋白和目的蛋白，流速2.0ml/min，洗脱液为含有50mM咪唑的20mmol/LpH7.2的Tris-HCl缓冲液，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分批收集含角蛋白酶酶活的洗脱液；洗脱过程只出现一个目的蛋白洗脱峰，后续测酶活及SDS-PAGE蛋白电泳发现，无论是原始酶，还是突变酶，峰顶收集的酶液为最纯本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.角蛋白酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本的第78位进行突变。/n

【技术特征摘要】
1.角蛋白酶突变体，其特征在于，以氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的角蛋白酶为亲本，将亲本的第78位进行突变。


2.根据权利要求1所述的角蛋白酶突变体，其特征在于，所述突变体为以下所述任一：
(a)将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为半胱氨酸；
(b)将亲本角蛋白酶的第78位苏氨酸突变为谷氨酸。


3.编码权利要求1或2所述突变体的基因。


4.携带权利要求3所述基因的表达载体。


5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pP43NMK。


6.表达权利要求1或2所述突...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，苗周迪，谈沐阳，陈坚，郭荣，李江华，邓小华，
申请(专利权)人：江南大学，武汉工控工业技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32