一种腈水合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种腈水合酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明专利技术对腈水合酶氨基酸基序中β亚基上的第48号构建的单点突变体L48D和L48H的酶活分别为750.26±1.63U/mg、820.01±0.98U/mg，与未进行改造的野生型腈水合酶的比酶活220.30±2.28U/mg相比，都有明显的提高。其中，突变体L48D与突变体L48H的酶活分别为野生型的3.4和3.7倍。上述这两个氨基酸残基的突变显著改善腈水合酶催化活性，有利于应用于工业上精细化学品如烟酰胺的生产，提高催化效率，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种腈水合酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种腈水合酶突变体及其应用，属于生物工程

技术介绍
腈水合酶(Nitrilehydratase，简称NHase，EC4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在精细化学品烟酰胺的工业生产上有着巨大的应用潜力。酰胺类的生物法生产技术是生物法替代化学法的典型案例，具有绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，符合可持续发展和绿色生产理念。酰胺类产品在工业、农业及医药等领域有着极大的应用价值，尤其以烟酰胺和丙烯酰胺的生物催化最为常见。其中，烟酰胺是一种重要的化工生产原料，用途广泛。烟酰胺本身为维生素B12的辅酶，可以作为维生素补剂，还可用来合成多种维生素衍生物，市场前景广阔。腈水合酶不仅在应用层面展现了重要作用，另外，作为一种能够结合钴离子或铁离子的金属酶，其催化活性和稳定性也引起了研究者的广泛关注。腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。许多研究团队通过构建共价键相互作用、盐键和添加Link以及亚基融合等策略提高其稳定性，但是几乎没有通过酶的改造同时提高其酶活和稳定性，甚至拓宽底物谱的报道。温泉热碱芽孢杆菌(CaldalkalibacillusthermarumTA2.A1)来源的腈水合酶具有较好的热稳定性，基于这一特性，可以尝试提高其催化活性及拓宽底物谱。目前工业上的大宗化学品生产，比如丙烯酰胺和烟酰胺，除了受限于热稳定性外，催化效率也不高。因此，提高腈水合酶的稳定性和催化活性具有极大的应用价值和广阔的应用前景。
技术实现思路
针对现有的技术难点及存在的问题，本专利技术提供了一种来源于温泉热碱芽孢杆菌(CaldalkalibacillusthermarumTA2.A1)的腈水合酶的氨基酸基序及其在底物催化生产上的应用。本专利技术的第一个目的是提供腈水合酶突变体，含有α亚基、β亚基以及调控蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述α亚基的氨基酸序列如SEQIDNO.1。在本专利技术的一种实施方式中，所述β亚基的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5。在本专利技术的一种实施方式中，所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3。本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。本专利技术的第三个目的是提供含有所述基因的载体。本专利技术的第四个目的是提供所述腈水合酶突变体的微生物细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述质粒为pET-24(+)。本专利技术的第五个目的是提供一种提高腈水合酶酶活力的方法，是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的腈水合酶β亚基第48位亮基酸突变为天冬氨酸或组氨酸。本专利技术的第六个目的是提供一种重组表达所述腈水合酶突变体的方法，将表达所述腈水合酶突变体的微生物细胞接种于LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG于24℃诱导12-16h。本专利技术的第七个目的是提供上述的腈水合酶突变体或含有腈水合酶突变体的微生物细胞在生产含烟酰胺的产品中的应用。有益效果：本专利技术提供了一段Cal.t-NHase的氨基酸基序及突变体的氨基酸基序，该基序与其他来源的腈水合酶基序在α亚基上酶活中心的108、111和113位点均是高度保守的，它们分别与钴离子形成配位键。本专利技术对腈水合酶氨基酸基序中β亚基上的第48号构建的单点突变体L48D和L48H的酶活分别为750.26±1.63U/mg、820.01±0.98U/mg，与未进行改造的野生型腈水合酶的比酶活220.30±2.28U/mg相比，都有明显的提高。其中，突变体L48D的酶活约为野生型的3.4倍，突变体L48H的酶活约为野生型的3.7倍。上述这两个氨基酸残基的突变显著改善腈水合酶催化活性，有利于应用于工业上精细化学品如烟酰胺的生产，提高催化效率，降低生产成本。附图说明图1：纯酶的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白Marker，1:pET24a，2：WT，3：L48D，4：L48H。图2：Cal.tNHase野生酶WT与突变体L48D、L48H、A41K、Y46E以及V126K的比酶活。图3：Cal.tNHase突变体L48H应用生产烟酰胺。具体实施方式1、培养基：LB培养基(L-1)：胰蛋白胨10g，NaCl10g，酵母提取物5g，pH7.0，配制固体培养基时添加琼脂粉20g。无甘油TB培养基(L-1)：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，KH2PO42.31g，K2HPO412.54g。2、缓冲液：结合缓冲液：20mMNa2HPO4·12H2O，280mMNaCl，6mMKCl，pH7.4洗脱缓冲液：20mMNa2HPO4·12H2O，280mMNaCl，6mMKCl，2.5mMd-Desthiobiotin，pH7.4。腈水合酶的酶活力(U)：单位酶活力定义为25℃下，每分钟催化烟腈生成1μmol烟酰胺所需要的酶量。腈水合酶的比酶活(U/mg)：每毫克腈水合酶所具有的酶活力。实施例1：腈水合酶突变体的质粒构建以野生型质粒pET24a(+)-Cal.tWT(张赛兰,李婷,程中一等.新型耐热腈水合酶的异源表达及其催化工艺研究[J].食品与发酵工业,2020,第46卷(14):108-113中pET24a(+)-Cal.tNHase)为模板，将突变位点L48D和L48H设计在引物上，通过PCR扩增出碱基序列发生突变的质粒，所用引物序列如表1所示，扩增体系如表2所示。PCR扩增反应条件为95℃预变性3min，98℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1min45s，72℃延伸5min，共30个循环。将PCR产物用DpnI消化酶消化2-3h，转化E.coliDH5α，涂布于含50mg/L卡那霉素的LB培养基平板，37℃倒置过夜培养。挑取单菌落接种于5mLLB培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，使用商品化质粒抽提试剂盒获得重组质粒，由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，最终得到重构质粒pET24a(+)-L48D，pET24a(+)-L48H。表1引物序列(注：F代指上游引物，R代指下游引物)表2PCR扩增体系实施例2：野生酶WT与各突变体的表达与纯化步骤1：将实施例1获得的Cal.tNHase的野生型pET24a(+)-Cal.tWT及重构质粒pET24a(+)-L48D，pET24a(+)-L48H分别转化E.coliBL21(DE3)，挑取单菌落至5mLLB培养基，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)接种量转接至100mL2×YT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，含有α亚基、β亚基以及调控蛋白；/n所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1；/n所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5；/n所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。/n

【技术特征摘要】
1.一种腈水合酶突变体，其特征在于，含有α亚基、β亚基以及调控蛋白；
所述α亚基的氨基酸序列如SEQIDNO.1；
所述β亚基的氨基酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5；
所述调控蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3。


2.编码权利要求1所述腈水合酶突变体的基因。


3.含有权利要求2所述基因的重组载体。


4.表达权利要求1所述腈水合酶的微生物细胞。


5.如权利要求4所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞包括大肠杆菌。


6.如权利要求4或5所述的微生物细胞，其特征在于，所述细胞是以大肠杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，江诗进，程中一，刘中美，崔文璟，周丽，韩来闯，郭军玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32