一种源于沙门氏菌噬菌体基因编码的蛋白在作为革兰氏阴性菌裂解酶中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种源于沙门氏菌噬菌体基因编码的蛋白在作为裂解酶中的应用，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码所述蛋白的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术首次发现SEQ ID NO.2所示的蛋白具备裂解酶的作用，且能自内裂解大肠杆菌等革兰氏阴性细菌，该裂解酶的裂解效应高，对多种不同的大肠杆菌以及沙门氏菌均具备裂解效果。

【技术实现步骤摘要】
一种源于沙门氏菌噬菌体基因编码的蛋白在作为革兰氏阴性菌裂解酶中的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种源于沙门氏菌噬菌体基因编码的蛋白在作为裂解酶中的应用。
技术介绍
噬菌体编码产生的裂解酶在噬菌体侵染细菌的后期产生，裂解酶通过作用于细菌细胞壁的肽聚糖层达到裂菌的效果。目前，国际上对于阳性菌裂解酶的研究较多，由于其不存在细胞壁外膜，可以通过将外源加入的裂解酶直接作用于细菌，通过裂解细菌细胞壁达到裂菌、杀菌的效果。然而对于革兰氏阴性菌裂解酶，其存在细胞壁外膜，对于外源添加的裂解酶具有高度抗性，目前研究中多使用透膜剂与裂解酶联用，研究发现存在少部分裂解酶具有独立裂解阴性菌的能力，这被推测与裂解酶自身的带电荷性质有关。大多数噬菌体裂解酶具有双结构域的特点，即N端的催化结构域与C端的结合结构域，结合结构域负责与宿主细菌细胞壁上的特异性位点相结合，催化结构域则能够特异性的切断肽聚糖上的化学键，从而达到裂解细菌的效果。此外，还有部分具有其它结构特点的裂解酶，比如部分革兰氏阴性菌裂解酶的催化域处于C端，结合域位于N端；一些裂解酶还具有多个结合结构域或不同催化结构域串联的结构。随着测序技术、大规模病毒宏基因组学和培养技术的发展，数据库中完整的噬菌体基因组序列越来越多，截至2019年9月，其基因组量超过8000，继续研究新噬菌体基因组有利于我们进一步理解噬菌体基因组的多样性及噬菌体与细菌之间的相互作用机制。噬菌体中还有许多功能蛋白需要挖掘，可以通过ORF预测、功能预测、毒力因子或耐药因子预测，为噬菌体后续在食品、医学及农业等领域的安全应用提供科学依据，此外，可以在其功能基因组学分析的基础上对噬菌体蛋白的开发、噬菌体的进化及裂解机制等进行研究。然而，目前通过软件对裂解酶功能进行预测仍有较高的不准确性，如对于预测具有裂解功能的裂解酶，经实验验证具有裂解活菌能力的仅占5％左右。噬菌体裂解酶因其高效的杀菌性、种属特异性和安全性，使其在医疗、农业、食品安全等领域具有广阔的应用前景，目前，革兰氏阳性菌裂解酶已被应用于食品安全领域，成功消除食源性病原菌。然而对于革兰氏阴性菌裂解酶，由于其外膜的制约，导致其相关的应用实例较少。裂解酶通过自内裂解革兰氏阴性菌形成的菌蜕细胞，可用于菌蜕疫苗或活性物质递送载体的研究，然而并非所有裂解酶都具有良好的自内裂解效果，因此部分裂解酶不具备制作革兰氏阴性菌菌蜕细胞的能力。菌蜕是来自革兰氏阴性细菌的细胞外膜，其不含所有的细胞质成分，但具有完整的细胞形态，包括所有的细胞表面结构。因此菌蜕可用作疫苗、药物或活性物质的递送载体等。与传统的疫苗相比，菌蜕作为疫苗具有靶向性、固有佐剂特性和裂解过程不产生变性从而保留所有抗原决定簇等优势。目前，菌蜕细胞已经在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌等多种菌株中构建成功。
技术实现思路
一种源于沙门氏菌噬菌体基因编码的蛋白在作为裂解酶中的应用，所述的蛋白序列为SEQIDNO.2所示，编码其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种源于沙门氏菌噬菌体基因编码的蛋白在作为裂解酶中的应用，所述的蛋白序列为SEQIDNO.2所示，所述的应用包括利用该蛋白直接制备成裂解酶，该裂解酶可直接通过添加诱导剂裂解细胞，无需添加任何其他材料，可用于蛋白表达中的细胞破碎；本专利技术的应用还包括利用上述编码该蛋白的基因制备成菌蜕(致病性大肠杆菌及沙门氏菌)，制备的菌蜕细胞用作疫苗制备的抗原物质，还可作为药物、异源抗原、核酸等的递送载体，其由于缺乏内含物而更加安全。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1.本专利技术首次发现SEQIDNO.2所示的蛋白具备裂解酶的作用，且能自内裂解大肠杆菌与沙门氏菌等革兰氏阴性细菌；2.本专利技术提供的裂解酶的裂解效应高，对多种不同的革兰氏阴性菌均具备裂解效果。附图说明图1为插入基因ORF-40的PCR扩增产物。图2为重组质粒转化子的菌液PCR验证；其中，A为大肠杆菌BL21(DE3)-pBAD24-ORF40菌液PCR验证；B为大肠杆菌BL21(AI)-pBAD24-ORF40菌液PCR验证；C为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS-pBAD24-ORF40菌液PCR验证；M：MarkerMarkerDL2000；泳道1-3：同一种菌挑取了3个转化子做验证。图3为自诱导工程型大肠杆菌裂解曲线；其中，A为E.colitrans5α-pBAD24-ORF40的裂解曲线、B为E.coliBL21(DE3)-pBAD24-ORF40的裂解曲线、C为E.coliBL21(AI)-pBAD24-ORF40的裂解曲线、D为E.coliBL21(DE3)plySs-pBAD24-ORF40的裂解曲线。图4为氯霉素抗性重组载体构建和转化子的菌液PCR验证。图5为含有重组溶菌质粒pBAD24-ORF40的沙门氏菌和大肠杆菌的裂解曲线。具体实施方式下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本专利技术。本领域技术人员可以理解到，在不背离本专利技术的精神和原则的前提下，对本专利技术的任何平行改变和改动都将落入本专利技术的保护范围内，本专利技术所述的技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：构建工程菌株及自裂解曲线的测定1.裂解酶基因克隆及pBAD24-ORF40载体构建以ORF40(SEQIDNO.1所示，对应的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示)的碱基序列为模板设计插入基因的上下游引物ORF40-F和ORF40-R，以质粒pBAD24的序列为模板设计质粒线性化的上下游引物pBAD24-F和pBAD24-R，插入基因的引物ORF40-F和ORF40-R与质粒pBAD24的引物pBAD24-F和pBAD24-R具有同源序列，由上海生工公司合成。orf40-f:ttgggctagcaggaggaattcaccatgaagtcgcgtcgaagaagaorf40-r:caaaacagccaagcttgcacgttattattgcaccggttttgacapbad24-f:taacgtgcaagcttggctgttttgpbad24-r:ggtgaattcctcctgctagcccaaPCR扩增目的基因ORF40的程序如下：以1μL基因为模板，上下游引物ORF40-F和ORF40-R各加入100ng进行PCR扩增，PCR条件为：(1)94℃预变性10min；(2)94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；(3)72℃延伸5min。载体pBAD24的线性化PCR扩增程序如下：以1μL基因为模板，上下游引物pBAD24-F和pBAD24-R各加入100ng进行PCR扩增，PCR条件为：(1)98℃预变性30sec；(2)98℃变性10sec，60℃退火30sec，72℃延伸2m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种源于沙门氏菌噬菌体基因编码的蛋白在作为裂解酶中的应用，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种源于沙门氏菌噬菌体基因编码的蛋白在作为裂解酶中的应用，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的应用，编码所述蛋白的基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。


3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锦铨，徐偲月，晏婷，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42