一类高比活的融合木聚糖酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Lucky9的扩张蛋白(Expansin)与木聚糖酶(Xylanase)的融合蛋白ERX为母本，采用分子生物技术进行氨基酸突变，得到一类高比活且热稳定性高的融合木聚糖酶突变体。所述突变体包括突变体M1(具有Q226H，G232R，S241P，N251D，S398C位点突变)，突变体M2(具有Q226H，G232R，S241E，N251D，S398C位点突变)，突变体M7(具有Q226H，N251D，S398C位点突变)。本发明专利技术所述突变体具有催化效率高、热稳定性好的优良性质，能够完全满足工业应用需求，将其应用于木聚糖的催化反应中能够提高产物低聚木糖的生产效率。催化反应中能够提高产物低聚木糖的生产效率。

【技术实现步骤摘要】
一类高比活的融合木聚糖酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于功能基因改造
，具体涉及一类高比活的木聚糖酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]低聚木糖是由2-7个木糖分子以β-1,4糖苷键结合而形成的功能性低聚糖，其中以木二糖、木三糖和木四糖为主要功能成分。低聚木糖是目前所有功能糖中性能最稳定、功能性最强、摄入量最少的益菌因子，其甜味纯正，增值双歧杆菌的功效是其他功能性寡糖类20倍以上。同时，难以为人体消化吸收，能量值几乎为零。因此，低聚木糖在食品、医药和饲料等领域有着广阔应用前景。
[0003]木聚糖广泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等农业废弃物，其碳骨架中的β-1,4-木糖苷键可通过木聚糖酶水解生产低聚木糖。
[0004]中国专利文献CN108570107A公开了将来自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Lucky9的扩张蛋白(Expansin)与木聚糖酶(Xylanase)进行融合，得到的融合蛋白EXCL-EK2-XYN(以下简称ERX)。该融合蛋白可显著增加木聚糖酶的吸附能力，且能打开木质纤维素的天然结构。所述融合蛋白通过吸附-催化耦合技术水解玉米芯，提高低聚木糖的制备效率。吸附融合蛋白后的玉米芯可直接用于低聚木糖的生产，在生产完成后，融合蛋白仍然保留在玉米芯上，这样的反应上清仅含有目标产物低聚木糖，通过一步简单离心即可获得高纯度的目标产物。但该融合蛋白的稳定性较差，应用于水解时较易染菌，不能完全满足工业化的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术针以现有技术融合木聚糖酶ERX基础，对其进行了探索与研究，获得了一类高比活的且热稳定性高的融合木聚糖酶突变体。
[0006]本专利技术具体技术方案如下：一种融合木聚糖酶突变体，所述突变体在SEQ ID NO:1所示的融合木聚糖酶的氨基酸序列基础上具有Q226H、N251D和S398C位点突变。
[0007]进一步的，所述突变体还可以具有G232R、S241P或S241E中的一种或几种位点突变。
[0008]优选的，具有G232R和S241P位点突变或者G232R和S241E位点突变。
[0009]本专利技术另一目的在于提供一种DNA分子，所述DNA分子编码本专利技术所述的融合木聚糖酶突变体。
[0010]本专利技术另一目的在于提供一种融合木聚糖酶突变体的表达载体，表达如本专利技术所述的木聚糖酶突变体。所述表达载体，含有编码本专利技术所述的融合木聚糖酶突变体的DNA分子。
[0011]所述表达载体为质粒、噬菌体、病毒或宿主细胞。
and Accessibility Calculation for Protein(ver.1.2)在线服务器对突变前后的氨基酸残基进行计算，按突变位点与活性中心相对距离建库(库1-Y224/Q226/N251，库2-W225，库3-G232/S241，库4-S398)。所用的单点突变引物如下：PrimerSequence(5'to 3') Y224X-FAAAGCTAGCACAGACnnnTGGCAAAATTGGACTSEQ ID NO：3Y224X-RAGTCCAATTTTGCCAnnnGTCTGTGCTAGCTTTSEQ ID NO：4W225X-FGCTAGCACAGACTACTGGnnnAATTGGACTGATSEQ ID NO：5W225X-RATCAGTCCAATTnnnCCAGTAGTCTGTGCTAGCSEQ ID NO：6Q226X-FGCACAGACTACTGGnnnAATTGGACTGATGGGSEQ ID NO：7Q226X-RCCCATCAGTCCAATTnnnCCAGTAGTCTGTGCSEQ ID NO：8G232X-FAATTGGACTGATGGGnnnGGTATAGTAAACGCTSEQ ID NO：9G232X-RAGCGTTTACTATACCnnnCCCATCAGTCCAATTSEQ ID NO：10V238X-FGGTATAGTAAACGCTnnnAATGGGTCTGGCGGGSEQ ID NO：11V238X-RCCCGCCAGACCCATTnnnAGCGTTTACTATACCSEQ ID NO：12S241X-FAACGCTGTTAATGGGnnnGGCGGGAATTACAGTSEQ ID NO：13S241X-RACTGTAATTCCCGCCnnnCCCATTAACAGCGTTSEQ ID NO：14N251X-FAGTGTTAATTGGTCTnnnACCGGAAATTTTGTTSEQ ID NO：15N251X-RAACAAAATTTCCGGTnnnAGACCAATTAACACTSEQ ID NO：16S398X-FGGATATCAAAGTAGTGGAnnnTCTAACGTAACAGTGTGGSEQ ID NO：17S398X-RCCACACTGTTACGTTAGAnnnTCCACTACTTTGATATCCSEQ ID NO：18nnn对应不同氨基酸的密码子如下：GCA(Ala)、TGT(Cys)、GAT(Asp)、GAA(Glu)、TTT(Phe)、GGC(Gly)、CAT(His)、ATT(Ile)、AAA(Lys)、CTG(Leu)、ATG(Met)、AAT(Asn)、CCG(Pro)、CAG(Gln)、CGT(Arg)、TCA(Ser)、ACA(Thr)、GTT(Val)、TGG(Trp)、TAT(Tyr)。
[0025]以融合木聚糖酶ERX的基因序列(SEQ ID NO：2)为模版，参照Vazyme生物产品及操作手册，使用上述引物对，全质粒扩增出定点突变序列。PCR产物使用Dpn I进行酶切处理，模板消化结束后，采用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，并涂布于含有100μg/ml硫酸卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养过夜。突变结果由安徽通用生物公司进行序列测定完成验证。
[0026]对上述4个突变库中共计284株突变体进行筛选后得到如下突变：N251D/Q226H，N251D/Q226T，S241E/G232R，S241P/G232E，S398C。将得到的突变进行组合，得到12种组合方式：突变体M1(Q226H，G232R，S241P，N251D，S398C)；突变体M2(Q226H，G232R，S241E，N251D，S398C)；突变体M3(Q226T，G232R，S241P，N251D，S398C)；突变体M4(Q226T，G232R，S241E，N251D，S398C)；突变体M5(Q226H，N251D，G232R，S241E)；突变体M6(Q226H，N251D，G232E，S241P)；突变体M7(Q226H，N251D，S398C)；突变体M8(Q226T，N251D，G232R，S241E)
突变体M9(Q226T，N251D,G232E，S241P)突变体M10(Q226T，N251D,S398C)；突变体M11(G232R，S241E，S398C)；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合木聚糖酶突变体，其特征在于所述突变体在SEQ ID NO:1所示的融合木聚糖酶的氨基酸序列基础上具有Q226H、N251D和S398C位点突变。2.根据权利要求1所述的融合木聚糖酶突变体，其特征在于所述突变体进一步具有G232R、S241P或S241E中的一种或几种位点突变。3.根据权利要求2所述的融合木聚糖酶突变体，其特征在于所述突变体进一步具有G232R和S241P位点突变或者G232R和S241E位点突变。4.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1-3任一项所述的融合木聚糖酶突变体。5.一种融合木聚糖酶突变体的表达载体，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：高振，吴斌，韦利军，马江锋，王毳，何冰芳，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：