一种长效犬α干扰素融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种长效犬α干扰素融合蛋白及其制备方法和应用。其制备为将犬α干扰素以及CSA截短肽进行密码子优化之后，合成于质粒载体上，双酶切后克隆获得的目的片段，Linker连接得到重组质粒载体蛋白，重组质粒经酶切线性化后导入表达宿主菌得到重组酵母菌，经诱导表达、去糖基化、层析纯化得到目的蛋白即犬α干扰素融合蛋白。采用了高效的毕赤酵母甲醇诱导分泌表达系统建立融合蛋白，同时选用具有高稳定性的CSA截短肽、Linker以及高活性的长效犬α干扰素，可用于制备抗病毒药物。可用于制备抗病毒药物。可用于制备抗病毒药物。

【技术实现步骤摘要】
一种长效犬
α
干扰素融合蛋白及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物基因工程的
，具体涉及一种长效犬α干扰素融合蛋白及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]犬α干扰素(CaIFN-α)是一种具有广谱抗病毒、免疫调节、抗肿瘤等生物活性的蛋白，抗病毒活性为犬α干扰素的主要生物学活性，广泛用于犬病毒性疾病的防治，包括：犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬腺病毒、犬副流感、犬冠状病毒感染、犬疱疹病毒感染、犬病毒性角膜炎及其他病毒性疾病。其作用机制为犬α干扰素通过一系列的信号传导刺激机体产生ISG(干扰素刺激基因)产物，ISG类产物包括多种抗病毒蛋白，能够有效抑制病毒的复制。同时还可通过提高机体的免疫效应和调整病毒转录过程等有效方式来实现其抗病毒作用。
[0003]现有技术中犬α干扰素的相关研究中存在表达量不高、活性低及半衰期短等问题。犬α干扰素的外源表达主要在大肠杆菌、毕赤酵母、动物细胞三种表达系统中的表达，在大肠杆菌表达系统缺少将蛋白质有效的释放分泌机制，面临产量小、包涵体表达的问题，存在变复性、去除内毒素及热源等繁琐的蛋白纯化工艺，同时大肠杆菌表达系统无法有效形成二硫键，不利于犬α干扰素的正确折叠，影响其天然构象及稳定性，进而影响其生物学活性；利用动物细胞表达则存在着工业复杂、成本较高、大规模产业化生产较为困难的情况，在相应表达系统中由于蛋白的翻译折叠等过程中还普遍存在表达的犬α干扰素生物活性低的现象。
[0004]在犬病毒病预防方面，国内运用较多的是疫苗和抗体，但是由于母源抗体的干扰及毒株的抗原漂移，有时会导致免疫失败。同时犬α干扰素具有半衰期短的特性，为4h左右，使得应用上存在半衰期较短的瓶颈，犬α干扰素在体内存留时间的长短极大地影响到使用剂量和治疗效果。防止犬α干扰素在体内迅速降解、延长半衰期成为犬α干扰素改造的研究热点，因此研制安全高效的长效犬α干扰素抗病毒制剂具有重大意义。在长效性修饰的研究中，血清白蛋白是现有天然载体蛋白之一，是血浆的主要成分，在体内有维持血液渗透压，运输营养和其它重要生物物质的作用，具有有安全无毒、生物相容性好、低免疫原性，半衰期长(达两周)等稳定剂和多肽运载蛋白的必需性质，它已成功地在哺乳动物细胞和酵母中实现高效表达。现有研究有采用犬血清白蛋白CSA进行犬α干扰素的融合表达的研究，但其所用的CSA为全长序列，全长CSA融合表达时会出现不同程度的断裂及酶降解的情况，给纯化及活性的测定带来诸多不利的影响。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种长效犬α干扰素融合蛋白及其制备方法和应用，所得长效犬α干扰素融合蛋白生物学活性高、半衰期延长、稳定性好、不易降解以及二硫键易于形成。
[0006]本专利技术的
技术实现思路
如下：
[0007]本专利技术提供了一种长效犬α干扰素融合蛋白，所述犬α干扰素融合蛋白的蛋白片段包括犬α干扰素以及包括CSA截短肽；
[0008]所述长效犬α干扰素融合蛋白包括4种组合，4种融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1～4所示；
[0009]所述犬α干扰素CaIFN-α氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；
[0010]所述蛋白片段还包括Linker柔性连接肽(GGGGS)n(其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示)以及His-Tag(其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示)；
[0011]所述蛋白片段的融合方式包括，CSA截短肽位于犬α干扰素的N端，Linker位于CSA截短肽和犬α干扰素之间、His-Tag位于犬α干扰素的C端；
[0012]所述CSA截短肽为CSA氨基酸序列(如序列表SEQ ID NO.8)的截短得到，所述截短肽具有高度的稳定性，所述截短的氨基酸序列为29～608，包括4个截短肽CSA1、CSA2、CSA3以及CSA4，4个截短肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.9～12所示；所述CSA截短肽不限于表达犬α干扰素；CSA的截短肽不限于第29～608内的任意氨基酸片段。
[0013]所述Linker包括柔性连接肽(GGGGS)n，n＝1～10，通过调整n的个数，可以优化该连接肽的长度；
[0014]所述His-Tag位于犬α干扰素的C端。
[0015]本专利技术还提供了一种长效犬α干扰素融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0016]将犬α干扰素以及CSA截短肽进行密码子优化之后，合成于质粒载体上，双酶切后克隆获得的目的片段，Linker连接得到重组质粒CSAL-CaIFN-α-载体蛋白，重组质粒经酶切线性化后导入表达宿主菌得到重组酵母菌，经诱导表达、去糖基化、层析纯化得到目的蛋白即长效犬α干扰素融合蛋白。
[0017]所述密码子包括毕赤酵母密码子；
[0018]所述表达宿主菌包括毕赤酵母宿主菌，所述毕赤酵母宿主菌包括X33、GS115、KM71以及SMD1168，所述毕赤酵母宿主菌有利于二硫键的形成；
[0019]所述重组质粒的表达载体包括pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC、pGAPZαA、pPIC9K、pPIC9、pHIL-S1以及pYAM75P；
[0020]所述诱导表达包括采用甲醇诱导技术；
[0021]本专利技术还提供了一种长效犬α干扰素融合蛋白用于制备抗病毒药物。
[0022]本专利技术的有益效果如下：
[0023]本专利技术的长效犬α干扰素融合蛋白的外源表达具有表达含量高、糖基化适度、二硫键易于形成、表达产物生物学活性好、背景蛋白质少、操作简便及易于工业化生产等特点，用于解决现有技术制备犬α干扰素生物学活性低、半衰期短、稳定性差、容易降解、二硫键难以形成、生产工艺复杂、纯化制备成本高等问题；本专利技术中优选的CSA截短肽的具有高稳定性，分子大小适中，不易断裂及酶解，在融合表达策略下能够显著地延长犬α干扰素的半衰期及增强生物学活性。其活性及稳定性均优于现有文献报道的犬α干扰素长效性修饰相关研究。
[0024]本专利技术的长效犬α干扰素融合蛋白采用了高效的毕赤酵母甲醇诱导分泌表达系统建立融合蛋白，同时选用具有高稳定性的CSA截短肽、Linker以及高活性的长效犬α干扰素，所制得的长效犬α干扰素融合蛋白可用于制备抗病毒药物。
附图说明
[0025]图1为重组质粒的构件示意图；
[0026]图2为重组质粒的PCR鉴定结果；
[0027]图3为重组酵母菌的PCR鉴定结果；
[0028]图4为重组酵母菌诱导上清的Western Blot结果。
具体实施方式
[0029]以下通过具体的实施案例以及附图说明对本专利技术作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的保护范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
[0030]若无特殊说明，本专利技术的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长效犬α干扰素融合蛋白，其特征在于，所述犬α干扰素融合蛋白的蛋白片段包括犬α干扰素以及CSA截短肽。2.由权利要求1所述的长效犬α干扰素融合蛋白，其特征在于，所述长效犬α干扰素融合蛋白的氨基酸序列包括如序列表SEQ ID NO.1～4所示的四种。3.由权利要求1所述的长效犬α干扰素融合蛋白，其特征在于，所述蛋白片段还包括Linker柔性连接肽(GGGGS)n以及His-Tag，其氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO.6～7所示。4.由权利要求3所述的长效犬α干扰素融合蛋白，其特征在于，所述蛋白片段的融合方式包括，CSA截短肽位于犬α干扰素的N端，Linker位于CSA截短肽和犬α干扰素之间、His-Tag位于犬α干扰素的C端。5.由权利要求1所述的长效犬α干扰素融合蛋白，其特征在于，所述CSA截短肽为CSA氨基酸序列的截短得到，所述截短的氨基酸序列为29～608，包括4个截短肽CSA1、CSA2、CSA3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昕，赖强，王弋，谢汝祝，段巧梅，彭小珍，覃伟恒，
申请(专利权)人：广州源博医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：