RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体公开了一种RGD4C融合抗TNFα纳米抗体的设计，表达及抗肿瘤活性研究。本发明专利技术公开了一种RGD4C融合的抗TNFα纳米抗体蛋白，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；该RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白的构建表达及抗肿瘤研究包括以下内容：设计三种不同构型RGD4C融合的TNFα纳米抗体；酵母表达载体构建；酵母表达系统诱导蛋白表达；目的蛋白进行镊柱纯化；融合蛋白体外抗MDA-MB-231肿瘤的增殖、转移作用研究；MDA-MB-231荷瘤裸鼠体内进行给药后评价肿瘤增殖、转移及EMT转化作用。研究确定本发明专利技术V-L-R-H构型的RGD4C融合抗TNFα纳米抗体，具有体内外抑制MDA-MB-231肿瘤细胞增殖、转移的作用，未来可进一步开发应用于乳腺癌的临床治疗中。治疗中。治疗中。

【技术实现步骤摘要】
RGD4C融合抗TNF
α
纳米抗体蛋白、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于融合纳米抗体蛋白，具体涉及一种RGD4C融合抗TNFα纳米抗体(RGD4C-anti-TNFα-Nanobody)、制备方法及其在抗三阴性乳腺癌中的应用。

技术介绍

[0002]乳腺癌是女性常见的癌症之一，约占女性所患癌症的30％左右。其中雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体-2表达均低于1％的乳腺癌类型即三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)占所有乳腺癌的15-20％，具有更强的增殖侵袭性和更差的临床预后。手术切除治疗、放疗、化疗是目前TNBC治疗的常用手段。但手术治疗极难切除干净，放疗具有极大的机体损伤，化疗易产生药物抵抗和剂量耐受，且预后都易复发
[1]。
[0003]TNFα最初被发现是因为其诱导实验性肿瘤快速出血坏死的能力，是一种主要的炎性细胞因子。1987年Leibovich在《Nature》发表文章证明低剂量的TNFα可促进肿瘤的增殖
[2]。它的结构是一种Ⅱ型跨膜蛋白，羧基端在胞外，氨基端在胞质内。TNFα存在跨膜型和游离型两种形式，跨膜型TNFα被切割后胞外端以游离态TNFα的形式存在。TNFα也存在TNFR1和TNFR2两种受体，两种受体发挥着不同的生理学作用。TNFα可激活不同的细胞反应通路，即细胞的存活与增殖、促炎基因的转录和细胞死亡。TNFR1结合TNFα后可以激活Ras/Raf/MEK1/ERK1,2以及PI3K/AKT信号通路促进细胞存活和增殖。TNFR2具有核转录因子NF-κB激活功能，可介导内皮/上皮酪氨酸激酶激活VEGFR2，促进血管生成和AKT的激活
[3-4]。研究表明，低浓度的TNFα发挥着促进肿瘤增殖和转移的作用，抗TNFα抗体可以体内抑制乳腺癌细胞的增殖和转移
[5]。在骆驼和鲨鱼体内存在一种特殊的抗体，抗体结构天然缺失轻链，克隆并表达重链可变区基因获得抗体片段，直径仅为几纳米，被称为纳米抗体Nanobody，简写为VHH(Variable region of heavy chain of heavy antibody)。该类型抗体具有高亲和活性，高稳定性，高表达量等特点，在肿瘤治疗和诊断中表现出优良的应用潜力
[6-7]。已有研究表明TNFα纳米抗体可以在体内外抑制乳腺癌细胞的增殖与转移
[8]。
[0004]整合素受体在静息的内皮细胞(Endothelial cell,EC)和其他正常组织中低表达而在多种肿瘤细胞表面高表达。它属于细胞粘附受体家族，为一种跨膜异二聚体，发挥着细胞外基质与细胞内骨架相互连接的作用。每种整合素都各由一个α和β亚基通过非共价键连接构成，18种α亚基和9种β亚基共形成24个整合素异二聚体。整合素αvβ3是整合素家族中最重要的成员之一，由一个αv(CD51)亚基和一个β3(CD61)亚基组成，又称玻连蛋白(Vitronectin,VN)受体。含有精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺(RGD)基序的多肽和蛋白能够特异性结合整合素αvβ3受体，RGD是整合素αvβ3受体结合的最小识别单位。整合素αvβ3参与细胞与细胞间或者细胞与ECM间的“inside-out”和“outside-in”两种过程的“cross-talk”作用
[9]。通过这些信号传导，整合素αvβ3参与肿瘤细胞的存活、增殖和转移等过程
[10]。
[0005]利用RGD对整合素αvβ3特异性结合活性，已有大量研究针对肿瘤的靶向治疗和靶向诊断。此外，RGD肽本身也具有直接杀伤肿瘤细胞和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。RGD4C即
a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism.J.Virol.72,9706
–
9713.

技术实现思路

[0019]本专利技术的目的在于提供一种RGD融合抗TNFα纳米抗体及其制备方法，并研究其在抗乳腺癌肿瘤活性中的应用，可以为进一步开发乳腺癌，特别是三阴性乳腺癌的临床治疗药物奠定基础。
[0020]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0021]本专利技术的第一个目的是提供一种RGD4C融合TNFα纳米抗体，所述RGD融合TNFα纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。构型为N端-VHH-Linker-RGD4C-6HIS-C端，Linker为(G4S)2。
[0022]本专利技术的第二个目的是提供编码上述RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0023]本专利技术的第三个目的是提供一种表达载体，所述表达载体包含SEQ ID NO.5所示编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因。
[0024]进一步的，所述表达载体是将SEQ ID NO.5所示编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因克隆到pPICZαA空载质粒中所得。
[0025]具体的，所述表达载体是PCR法扩增出SEQ ID NO.5所示RGD4C融合TNFα纳米抗体基因，将扩增出的基因片段和质粒载体pPICZαA用XhoI、XbaI内切酶于37℃双酶切，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的产物，16℃连接。
[0026]PCR扩增所用引物为：
[0027]上游引物P1：5
’-
gaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctcaggtgcagctggtggagtc-3
’
(SEQ ID No.7)；
[0028]下游引物P4：5
’-
agatgagtttttgttctagatcaatgatgatgatgatgatggcagaagcaatctccgc-3
’
(SEQ ID No.10)
[0029]本专利技术的第四个目的是提供一种重组细胞，所述重组细胞包含上述表达载体。
[0030]进一步的，所述重组细胞以酵母菌GS115为宿主细胞。
[0031]本专利技术的第五个目的是提供一种RGD4C融合TNFα纳米抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：制备上述的表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述RGD4C融合TNFα纳米抗体。
[0032]进一步的，上述RGD4C融合TNFα纳米抗体的制备方法的具体步骤为：将SEQ ID NO.5所示编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因进行PCR扩增，扩增产物经XhoI和XbaI内切酶于37℃双酶切，与经相同酶切的pPICZαA空载质粒16℃连接，得到表达载体，将该表达载体转化酵母菌GS115，培养转化体，经甲醇诱导表达，从培养物中分离纯化，获得RGD4C融合TNFα纳米抗体；
[0033]优选的，用于PCR扩增上述编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因的特异性引物为：<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RGD4C融合TNFα纳米抗体，其特征在于，所述RGD4C融合TNFα纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。2.编码权利要求1所述RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因。4.根据权利要求3所述表达载体，其特征在于，所述表达载体是将权利要求2所述编码RGD4C融合TNFα纳米抗体的基因克隆到pPICZαA空载质粒中所得。5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求3所述表达载体。6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以酵母菌GS115为宿主细胞。7.一种RGD4C融合TNFα纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备权利要求3所述的表达载体，用所述表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中分离得到所述RGD4C融合TNFα纳米抗体。8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：将权利要求2所述编码RGD4C融合TN...

【专利技术属性】
技术研发人员：纪雪梅，刘煜，韩田振，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：