一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR及其应用制造技术

本申请公开了一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR及其应用。所述CAR包括：结合到特异性靶抗原的细胞外抗原结合结构域、铰合与跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域；所述细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域含有如下蛋白的胞内段：DAP12和CD226。实验证明，将DAP12或DAP10作为CAR的铰合与跨膜结构域和部分共刺激信号传导结构域，与DNAM-1(CD226)或2B4等共同构成共刺激信号传导结构域，利用这些共刺激信号分子和CD3ζ来激活免疫细胞尤其是CD3

【技术实现步骤摘要】
一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及恶性肿瘤的免疫细胞治疗
，尤指一种嵌合抗原受体CAR及其应用，该CAR尤其适合于CIK细胞。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体(CAR，Chimeric Antigen Receptors)一般由胞外段、跨膜区和胞内段组成，能够特异性识别靶细胞表面肿瘤相关抗原，并通过受体-活化信号的机制促进其所在的效应细胞，如T细胞、NK细胞、NKT细胞等活化、增殖并杀伤该靶细胞。
[0003]CAR分子的结构设计已经经过了多代的修改完善。第一代CAR包含识别肿瘤细胞表面抗原的单链可变片段(scFv)、铰合和跨膜结构和激活T细胞的CD3ζ或FcRγ的胞内结构域，但由于其在体内的存活时间短，严重影响了其临床疗效。第二代CAR在胞内结构域中，增加了一个共刺激分子，如CD28、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)等，该代CAR在血液系统恶性肿瘤中获得了巨大成功。包含CD28的CAR能够产生更多的IL-2；包含4-1BB的CAR则可增强细胞的生存能力。为了使体内的CAR-T细胞获得更好的增殖能力、细胞因子分泌能力及肿瘤溶解活性，研究者们在三代CAR胞内区又增加了一个共刺激分子。四代CAR是通过增加“自杀基因”或者“细胞因子基因”，来控制细胞因子风暴或者增强CAR-T细胞的功能。目前已经上市的两个Anti-CD19 CAR-T均为二代CAR。对于肿瘤细胞的杀伤能力，二代CAR-T已经完全满足，但有引起细胞因子风暴和神经系统毒性的风险。
[0004]CIK(cytokine-induced killer)细胞即多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人体外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞，又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤优点。CD3、CD56双阳性细胞为其主要的效应细胞，还具有CCR7-、CD45RA
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、CD62L
low
、CD11a
+
、CD27
+
、CD28-、NKG2D
+
、NKp30
low
、NKp44-、NKp46-、NKG2A-、CD94-等特性。临床应用的CIK细胞为细胞亚群，包括CD3
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、CD56
+
的CIK、CD3
+
和CD8
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的CTL(细胞毒性T淋巴细胞)、CD3
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和CD4
+
的Th细胞(辅助性T细胞)等。CD3
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CD56
+
的CIK主要通过NKG2D来识别恶性肿瘤上的相应配体，经细胞-细胞接触后，发挥非MHC限制性的杀伤功能。CIK细胞已经被广泛用于血液系统恶性肿瘤、实体瘤的治疗中，并取得了一定的临床疗效。CIK细胞基本不会引起移植物抗宿主反应(GVHD)的特性，也让其成为了良好的CAR载体细胞。
[0005]目前，CAR-CIK的构建主要是以CD28作为共刺激分子为基础。然而以CD28-CD3ζ为胞内段的CAR-T细胞，会产生更多的不良反应。2017年Juno公司就放弃了其CD28ζCAR，而转向了4-1BBζCAR。即使是已经批准上市的Kite公司的Yescarta(同样以CD28作为共刺激分子)，在临床试验中也出现了严重临床神经毒性而引起广泛关注。如何充分发挥CIK细胞亚群中CD3
+
、CD56
+
的肿瘤抑制杀伤效应，如何控制CIK细胞亚群中CD3
+
CD8
+
的CTL可能引起的细胞因子风暴与神经系统毒性，需要我们进一步的研究。
[0006]DAP12即DNAX相关蛋白12，为一跨膜分子，以同源二聚体的形式与NKG2D-S分子相连，其胞内区含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，该基序中的酪氨酸在蛋白酪氨酸激酶
(PTK)的作用下发生磷酸化后，可被带有SH2结构域的其他PTK(如Syk或ZAPT0)和细胞分子所识别，启动激活相应的信号传导通路。
[0007]DNAM-1即CD226，也称为PTA1或TliSA1，约65KDa的跨膜蛋白，分布于NK细胞、血小板、单核细胞如树突状细胞和巨噬细胞、T细胞表面，是一种重要的NK细胞活化受体，能够通过PI-3K与SLP-76等途径刺激NK细胞的细胞因子分泌，也能够促进CD4
+
和CD8
+
T细胞的共刺激作用，并能通过非经典抗原递呈细胞途径促进激活CD8
+
细胞。
[0008]目前，CAR-CIK的CAR多以传统的scFv-CD8α(TM)-CD28-CD3ζ或scFv-CD8α(TM)-4-1BB-CD3ζ为基础，增加OX-40、CD27等共刺激分子演变而来。这些CAR在T细胞中已经取得了一定的效果，但是否适合CIK仍未可知。Andreas等发现scFv-Fc-CD28-CD3ζ-OX40的CAR修饰的CD3
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CD56
+
细胞，虽然能够分泌更多干扰素，但导致了更多的CD56
+
细胞激活诱导性细胞死亡(AICD)，从而减弱了其在体内的抗肿瘤功能。

技术实现思路

[0009]针对现有技术中存在的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR及其应用。该嵌合抗原受体CAR具有显著降低细胞因子风暴的效果，安全性更高。
[0010]一方面，本专利技术提供一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR，其包括：结合到特异性靶抗原的细胞外抗原结合结构域(也被称为抗原结合结构域或抗原特异性结合结构域，包含scFv)、铰合与跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域；
[0011]所述细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域(或共刺激结构域)，所述共刺激信号传导结构域含有如下蛋白的胞内段：DAP12和CD226；所述胞内段具体可为1-3个串联；
[0012]优选的，所述DAP12的胞内段序列包括SEQ ID No.1的第314-365位氨基酸序列；更优选的，所述DAP12的胞内段序列由SEQ ID No.6的第940-1095位核苷酸序列编码；所述DAP12的胞内段可为2-3个且串联；
[0013]优选的，所述CD226的胞内段序列包括SEQ ID No.No.1的第366-431位氨基酸序列；更优选的，所述CD226的胞内段序列由SEQ ID No.6的第1096-1293位核苷酸序列编码；所述CD226的胞内段可为2-3个且串联。
[0014]在上述嵌合抗原受体CAR中，所述DAP12的胞内段替换为DAP10的胞内段；优选的，所述DAP10的胞内段序列包括SEQ ID No.3的第312-335位氨基酸序列；更优选的，所述DAP10的胞内段序列由SEQ ID No.8的第934-1005位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CIK细胞的嵌合抗原受体CAR，其特征在于，其包括：结合到特异性靶抗原的细胞外抗原结合结构域、铰合与跨膜结构域以及细胞内信号传导结构域；所述细胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域含有如下蛋白的胞内段：DAP12和CD226；优选的，所述DAP12的胞内段序列包括SEQ ID No.1的第314-365位氨基酸序列；更优选的，所述DAP12的胞内段序列由SEQ ID No.6的第940-1095位核苷酸序列编码；优选的，所述CD226的胞内段序列包括SEQ ID No.No.1的第366-431位氨基酸序列；更优选的，所述CD226的胞内段序列由SEQ ID No.6的第1096-1293位核苷酸序列编码。2.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述DAP12的胞内段替换为DAP10的胞内段；优选的，所述DAP10的胞内段序列包括SEQ ID No.3的第312-335位氨基酸序列；更优选的，所述DAP10的胞内段序列由SEQ ID No.8的第934-1005位核苷酸序列编码；所述CD226的胞内段替换为2B4的胞内段，优选的，所述2B4的胞内段序列包括所述2B4的胞内段敲除包括第三个ITSM以后的序列，更优选的，所述2B4的胞内段序列包括SEQ IDNo.4的第356-475位氨基酸序列或SEQ ID No.4的第356-419位氨基酸序列，更优选的，所述2B4的胞内段序列由SEQ ID No.9的第1066-1425位核苷酸序列或SEQ ID No.9的第1066-1257位核苷酸序列编码。3.根据权利要求1或2所述的CAR，其特征在于，所述细胞内信号传导结构域还包括初级信号传导结构域，优选，CD3ζ，更优选，SEQ ID No.1的第432-543位氨基酸序列，更优选，由SEQ ID No.6的第1294-1629位核苷酸序列编码；所述铰合与跨膜结构域包括CD8α、CD28、4-1BB、DAP12、DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域中的任一种或至少两种，优选，DAP12、或DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域；更优选的，所述DAP12的拓扑结构域和跨膜结构域序列包括SEQ ID No.1的第280-313位氨基酸序列，更优选的，由SEQ ID No.6的第838-939位核苷酸序列编码，更优选的，所述DAP10的拓扑结构域和跨膜结构域序列包括SEQ ID No.3的第262-311位氨基酸序列，更优选的，由SEQ ID No.8的第784-933位核苷酸序列编码。4.根据权利要求1-3中任一所述的CAR，其特征在于，所述细胞外抗原结合结构域所针对的特异性靶抗原包括：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、CD138、CD171、BCMA、ROR1、WT-1、Pr3、erB-B2、MUC1、LeY、PSCA、EGP-40、HER-2、TAG-72、CD44v7/8、MAGE-A1、GD3、CAIX、NY-ESO-1、GD2、EGFRVIII、FAP、α叶酸受体、IL-13R-a2、EGP-2、间皮素、KDR、VEGF-R2、PSMA、CEA、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、IL-13中的任一种或至少两种；优选，CD19，更优选，所述细胞外抗原结合结构域的序列包括SEQ ID No.1的第28-269位...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昀，宋珂慧，郭栋，刑晓，
申请(专利权)人：济南赛尔生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：