一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体制造技术

本发明专利技术提供了一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体，其包括含有特点的核苷酸序列的慢病毒载体，本发明专利技术提供的慢病毒载体和使用这些载体转导的细胞，对于异染性脑白质营养不良具有一定的治疗效果。不良具有一定的治疗效果。不良具有一定的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体


[0001]本专利技术涉及异染性脑白质营养不良的基因治疗
，具体地，涉及一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体。

技术介绍

[0002]异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy,MLD)是一种常染色体隐性遗传病，因芳基硫酸酯酶A(arylsulphatase A,ARSA)或神经鞘脂激活蛋白B(sphingolipid activator protein B,SAP
‑
B)即脑硫脂激活蛋白的缺陷，使溶酶体内脑硫脂水解受阻，而沉积在中枢神经系统的白质、周围神经及肾、胆囊、肝等内脏组织，引起脑白质、周围神经脱髓鞘形成的进展性、退化性神经系统疾病。而ARSA单基因突变导致的异染性脑白质营养不良主要的原因在于，ARSA定位于22q13.3，ARSA基因突变使ARSA合成速度、稳定性降低，进而使其催化活性减弱,导致溶酶体内脑硫脂水解障碍，而在脑白质、周围神经及其他内脏组织内沉积。脑硫脂引起脱髓鞘的机制尚不清楚，其在少突胶质细胞和许旺细胞内的堆积可能抑制髓鞘的形成、促进脱髓鞘的进展。本专利技术涉及的异染性脑白质营养不良为ARSA单基因突变导致的疾病。
[0003]MLD通常分为晚婴型、青少年型、成年型，其中以晚婴型最常见，病情最为严重。目前尚无有效的治疗手段，酶替代治疗，因ARSA无法通过血脑屏障，无法改善颅内病变。异基因造血干细胞移植仅适用于晚婴型的症状出现前或青少年型早期患者，且脑白质损伤持续加重。国内外多家研究机构正在体内和体外两种模式的MLD基因治疗，如法国国家健康与医学研究院采用负载ARSA的腺相关病毒载体AAVrh.10cuARSA颅内注射，目前正在进行I/II期临床试验。但是颅内注射要求高，风险大，且是否能够获得持续的缓解仍未可知。Orchard Therapeutics采用PGK.ARSA.LV体外修饰患者的自体造血干细胞后再将这些细胞静脉输注患者，目前已经进入了III期临床试验。造血干细胞能够分化为各种体细胞，尤其是能分化为小神经胶质细胞的特性，使其成为了合适的ARSA递呈载体。异基因造血干细胞无法阻止患者脑白质持续损伤，表明ARSA的表达量是体外基因治疗的关键。本专利技术提供了一种在宿主细胞中ARSA的表达量并稳定表达的慢病毒载体，用于异染性脑白质营养不良的基因治疗。

技术实现思路

[0004]为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种提升宿主细胞中ARSA的表达量并稳定表达的慢病毒载体，用于异染性脑白质营养不良的基因治疗。
[0005]本专利技术构建了一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体，该载体包含骨髓增生性肉瘤病毒(MND)Promoter、芳基硫酸酯酶A(ARSA)cDNA、3＇
‑
LTR(Delta U3)、Insulator、异源聚腺苷酸序列等结构，其中骨髓增生性肉瘤病毒(MND)Promoter、芳基硫酸酯酶A(ARSA)cDNA
‑
3＇
‑
LTR(Delta U3)
‑
Insulator
‑
SV40 poly(A)的核苷酸序列见SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4。
[0006]进一步的，该载体的5＇的启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子。
[0007]进一步的，CMV启动子可被异源性启动子如HIV
‑
1 5＇
‑
LTR启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)或猿猴病毒(SV40)所替代。
[0008]进一步的，该载体的骨髓增生性肉瘤病毒(MND)Promoter为骨髓增生性肉瘤病毒增强子负调控区缺失的dl587rev引物结合位点取代的启动子。
[0009]进一步的，该载体的ARSA cDNA包括SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性；进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列；
[0010]更进一步的，通过密码子优化，该载体的ARSA cDNA包括SEQ ID NO：3所示的序列或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
[0011]更进一步的，该载体的Insulator包括SEQ ID NO：5所示的序列或与其具有至少80％同源性，优选至少85％同源性，进一步优选至少95％同源性的核苷酸序列。
[0012]进一步的，该载体的3＇
‑
LTR(Delta U3)包含一个或多个缺失/修饰，为自身失活(SIN)的LTR。
[0013]进一步的，该载体的异源聚腺苷酸序列为兔β
‑
球蛋白聚腺苷酸化序列。
[0014]进一步的，该载体的兔β
‑
球蛋白聚腺苷酸化序列可被其他异源聚腺苷酸序列如SV40 poly(A)序列或牛生长激素聚腺苷酸化序列所取代。
[0015]进一步的，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4可被插入pRRL MND GFP质粒中，分别构成慢病毒包装用载体质粒：
[0016]pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
insulator
‑
2和pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
insulator
‑
1。
[0017]进一步的，SEQ ID NO：4敲除Insulator序列，再插入pRRL MND GFP质粒中，构成慢病毒包装用载体质粒pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
3。
[0018]进一步的，pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
insulator
‑
1、pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
insulator
‑
2与pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
3的慢病毒载体相比，前两者的包装效率无明显差异，与pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
3相比包装效率下降。考虑到Insulator的阻断通读效应，pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
insulator
‑
1、pRRL
‑
MND
‑
ARSA
‑
insulator
‑
2更适合用于异染性脑白质营养不良的基因治疗。
[0019]进一步的，脐带血、骨髓、动员外周血或外周血中的单个核细胞，经过CD34磁珠单抗分选后，获得纯化的CD34+细胞。
[0020]进一步的，负载ARSA基因的慢病毒载体经由相应的转染步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体，其特征在于，其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体，其特征在于，所述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的5＇启动子为巨细胞病毒启动子、HIV
‑
1 5＇
‑
LTR启动子、劳氏肉瘤病毒启动子或猿猴病毒启动子中的一种。3.根据权利要求1所述的一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体中含有MND Promoter，所述MND Promoter为骨髓增生性肉瘤病毒增强子负调控区缺失的dl587rev引物结合位点取代的启动子。4.根据权利要求1所述的一种治疗异染性脑白质营养不良的慢病毒载体，其特征在于，所述SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列中均包含ARSA cDNA，所述SEQ ID NO：1中ARSA cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2或与其具有至少80％同源性；所述SEQ ID NO：4中ARSA cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或与其具有至少80％同源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昀，郭栋，宋珂慧，刑晓，姜舒，莫瑞麟，郭伟，
申请(专利权)人：济南赛尔生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：