评价化学品致突变性的工具和方法技术

本申请提供了重组哺乳动物细胞，其经过工程改造而表达包含CD59和荧光蛋白的融合蛋白。本申请还提供了利用所述重组哺乳动物细胞评价化学品致突变性的方法以及所述重组哺乳动物细胞在评价化学品致突变性中的用途。物细胞在评价化学品致突变性中的用途。

【技术实现步骤摘要】
评价化学品致突变性的工具和方法


[0001]本申请大体涉及分子生物学和化工技术的交叉
，具体而言，本申请提供了利用重组构建细胞评价化学品致突变性的工具和方法。

技术介绍

[0002]致突变效应评估是评价化学品毒性的重要指标，也是化学品健康危害鉴别的重要组成部分。现有的体外哺乳动物细胞致突变试验的特异度普遍偏低，而体内遗传毒性和致癌性试验的结果亦存在一致性难以准确判定的问题，并且时间、人力和资金成本均比较高，难以实现高通量评价。基于此，亟待寻找一种相对快速、准确的测试方法对化学品的致突变性进行评估和分析。

技术实现思路

[0003]第一方面，本申请提供了重组哺乳动物细胞，其经过工程改造而表达包含CD59和荧光蛋白的融合蛋白。
[0004]在一些实施方案中，重组哺乳动物细胞为人源性细胞。
[0005]在一些实施方案中，重组哺乳动物细胞是对选自以下的细胞工程改造获得的：293AD细胞、HEK细胞、CHO细胞、293T细胞、JY细胞、BM92细胞、WIN细胞、MOC细胞、MG细胞、NSO细胞、SP2细胞、BHK细胞、COS细胞、Hep G2细胞、A549细胞、HELA细胞、CVI细胞、COS细胞、R1610细胞、BALBC/3T3细胞、HAK细胞、SP2/O细胞、P3x63
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Ag3.653细胞、BFA
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1c1BPT细胞、RAJI细胞、HEK293细胞、CHO
‑
K1细胞、CHO
‑
S细胞、CHO/dhfr
>‑
细胞或BHK
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21细胞。
[0006]在一些实施方案中，荧光蛋白为绿色荧光蛋白或橙/红色荧光蛋白。在一些实施方案中，荧光蛋白为EGFP、GFP、mGFP5、D2EGFP、多色GFP变体、DsRed、DsRed2、DsRed
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express、mRFP1、mCherry或Kaede。
[0007]在一些实施方案中，在所述融合蛋白的结构中，CD59和荧光蛋白之间还包含柔性连接子。在一些实施方案中，柔性连接子为GS型连接子。在一些实施方案中，柔性连接子为SGSSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)、GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：4)、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO：5)S、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：6)、GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：7)或GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO：8)。
[0008]在一些实施方案中，编码融合蛋白的基因被整合到所述重组哺乳动物细胞的基因组中。
[0009]第二方面，本申请提供了评价化学品致突变性的方法，包括以下步骤：
[0010]使第一方面所述的重组哺乳动物细胞与待评价化学品接触；以及
[0011]用所述荧光蛋白的激发波长进行激发，在所述荧光蛋白的发射波长下采集所述重组哺乳动物细胞的图像或读取荧光值，其中相比于未与所述待评价化学品接触的所述重组哺乳动物细胞，所述图像中荧光强度的下降或所述荧光值的降低指示所述评价化学品具有
致突变性。
[0012]第三方面，本申请提供了第一方面所述的重组哺乳动物细胞在评价化学品致突变性中的用途。
[0013]第四方面，本申请提供了融合蛋白，其包含CD59和荧光蛋白，并且在所述CD59和所述荧光蛋白之间任选地包含柔性连接子。
[0014]第五方面，本申请提供了编码第四方面所述的融合蛋白的核酸分子。
[0015]第六方面，本申请提供了包含第五方面所述的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述载体为病毒载体。在一些具体实施方案中，病毒载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒或乳多泡病毒。
[0016]附图简要说明
[0017]图1显示了本申请实施例的重组哺乳动物细胞的荧光图像，其中荧光集中出现在细胞膜部分，证实细胞模型构建成功。
[0018]图2至图4显示了用不同浓度的甲基磺酸乙酯(EMS)处理本申请实施例的重组哺乳动物细胞24h、48h、72h后的CCK8细胞增殖测试结果。
具体实施方式
[0019]应理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
[0020]致突变效应评估是评价化学品毒性的重要指标，也是化学品健康危害鉴别的重要组成部分。
[0021]本申请的专利技术构思在一定程度上基于磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig
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a)基因突变分析，这是一种基于体内血液细胞的基因突变检测方法。磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig
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a)基因位于X染色体，编码N
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乙酰氨基葡萄糖转移酶复合物，主要参与糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接蛋白的合成。当Pig
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a基因突变时，GPI不能正常合成，多种细胞膜表面蛋白不能锚定在细胞表面，膜蛋白表达量显著降低。Pig
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a基因在哺乳动物和人体细胞中具有高度的保守型，用少量动物试验即可得出相对准确的结果，与传统方法相比更加高效准确，已被国际遗传毒性工作组(IWGT)及美国健康与环境科学研究所(HESI)列为传统实验组合的后续拓展方向，具有良好的应用前景。常规的Pig
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a基因突变检测需要将化学品灌胃处理大鼠28天，之后取血并采用流式细胞仪检测。因此，该检测中存在通量小、时间长、操作繁琐等技术瓶颈。
[0022]针对Pig
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a致突变试验的局限性，本申请的专利技术人研发体外细胞评价模型，其中从Pig
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a致突变试验中受影响的膜蛋白中筛选得到CD59蛋白，将其与荧光蛋白构建为融合蛋白，通过转基因技术对哺乳动物细胞进行工程改造，从而得到Pig
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a致突变试验的体外评价模型，从而基于荧光强度的评价，能快速、便捷、高通量地评价化学品诱导的致突变效应。
[0023]第一方面，第一方面，本申请提供了重组哺乳动物细胞，其经过工程改造而表达包含CD59和荧光蛋白的融合蛋白。
[0024]术语“哺乳动物”是指分类学分类上的哺乳纲的任何动物。哺乳动物可以指人或者非人灵长类动物。在评价化学品对于人类的毒性效应时，选择人源性细胞是更合理的。
[0025]在一些实施方案中，重组哺乳动物细胞是对选自以下的细胞工程改造获得的：293AD细胞、HEK细胞、CHO细胞、293T细胞、JY细胞、BM92细胞、WIN细胞、MOC细胞、MG细胞、NSO
细胞、SP2细胞、BHK细胞、COS细胞、Hep G2细胞、A549细胞、HELA细胞、CVI细胞、COS细胞、R1610细胞、BALBC/3T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组哺乳动物细胞，其经过工程改造而表达包含CD59和荧光蛋白的融合蛋白。2.如权利要求1所述的重组细胞，其中所述重组哺乳动物细胞是对选自以下的细胞工程改造获得的：293AD细胞、HEK细胞、CHO细胞、293T细胞、JY细胞、BM92细胞、WIN细胞、MOC细胞、MG细胞、NSO细胞、SP2细胞、BHK细胞、COS细胞、Hep G2细胞、A549细胞、HELA细胞、CVI细胞、COS细胞、R1610细胞、BALBC/3T3细胞、HAK细胞、SP2/O细胞、P3x63
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Ag3.653细胞、BFA
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1c1BPT细胞、RAJI细胞、HEK293细胞、CHO
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K1细胞、CHO
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S细胞、CHO/dhfr
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细胞或BHK
‑
21细胞。3.如权利要求1或2所述的重组细胞，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或橙/红色荧光蛋白，例如EGFP、GFP、mGFP5、D2EGFP、多色GFP变体、DsRed、DsRed2、DsRed
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express、mRFP1、mCherry或Kaede。4.如权利要求1
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3中任一项所述的重组细胞，其中所述CD59和荧光蛋白之间还包含柔性连接子，例如GS型连接子，例如SGSSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：3)、GSGGGSGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，高文晖，邵兵，
申请(专利权)人：北京市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：