一种用于复制型病毒检测的重组表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于复制型病毒检测的重组表达载体及其应用。所述重组表达载体包括含有荧光蛋白的编码基因和疱疹性口腔炎病毒G蛋白的部分编码基因的病毒载体。本发明专利技术设计特定结构的用于复制型病毒检测的重组表达载体，利于快速检测，可进一步用于制备复制型病毒，作为RCL检测的阳性对照品，利于提高检测效率、灵敏度、准确性和便捷性，且可适用于多种检测方法，检测结果更可靠，安全性更高。安全性更高。安全性更高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于复制型病毒检测的重组表达载体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种用于复制型病毒检测的重组表达载体及其应用。

技术介绍

[0002]近年来肿瘤免疫疗法和再生医学产品的临床研究不断深入，已有多个CAR
‑
T/TCR
‑
T细胞产品和干细胞/体细胞产品申报药品临床试验，涉及细胞类型多样，组织来源包括血液、上皮组织、骨髓、脂肪组织、肌肉组织、眼球、脐带、胎盘和牙髓等。
[0003]CAR
‑
T细胞的生产流程主要包括患者的外周血分离、T细胞的活化和富集、将CAR转入T细胞、CAR
‑
T细胞的体外扩增，以及最终形成制剂。由于转导效率高、目的基因表达稳定、持续时间长，慢病毒和γ
‑
逆转录病毒成为目前将CAR编码基因转入T细胞过程中应用最普遍的表达载体，复制型病毒(replication
‑
competent lentivirus，RCL)的产生是慢病毒和γ
‑
逆转录病毒载体生产和应用过程中最严重的风险因素，迄今，已应用于人体的慢病毒载体及相关细胞产品中尚未有检出RCL的报道，理论上目前采用的病毒包装系统降低了RCL出现的可能性，但未能完全排除，因此RCL仍作为重要的安全性风险关注点。
[0004]根据RCL产生的机制，人们已经发现了多种可能指示RCL的标志物。例如，包装质粒和转移质粒gag起始区域序列的同源性高，因而两质粒间可能重组产生RCL；另外，扩增得到的以VSV
‑
G作为包膜蛋白的RCL，可能将VSV
‑
G序列迁移至指示细胞的基因组中(参见：Sastry,L.,et al.,Certification assays for HIV
‑1‑
based vectors:frequent passage of gag sequences without evidence of replication
‑
competent viruses.Mol Ther,2003.8(5):p.830
‑
9.)，复制型病毒具有逆转录酶活性，PERT(product enhanced reverse transcriptase)的检出也可指示RCL，但需要考虑到指示细胞自身表达逆转录酶的情况(参加：Sastry,L.,et al.,Product
‑
enhanced reverse transcriptase assay for replication
‑
competent retrovirus and lentivirus detection.Hum Gene Ther,2005.16(10):p.1227
‑
36.)，综上，目前一般认为gag基因编码的p24蛋白及指示细胞中psi
‑
gag和VSV
‑
G序列的检出可反映RCL的存在。
[0005]对于临床级别的慢病毒载体，常用的检测方法有细胞培养法和直接qPCR法。FDA指导原则要求，假设患者的临床用剂量中含有1个RCL，对应的病毒上清的检测样本量应至少确保95％的检出可能性。直接qPCR法通过RT
‑
PCR扩增待测样品中RCL的标志性序列(psi
‑
gag，VSV
‑
G)检测，不涉及RCL在细胞中的扩增过程，耗时较短，检测方法相对简便，但该方法具有明显的缺点，在体外包装的病毒载体中往往存在残余质粒DNA的污染导致假阳性结果。此外，重组产生RCL的机制较为复杂，由于病毒包装系统多样，产生的RCL可能不具有PCR引物匹配的序列，因而假阴性结果也难以避免。
[0006]细胞培养法检测RCL时，将待测物与对HIV
‑
1易感并且可大量扩增病毒的细胞系(通常用C8166)孵育，细胞传代5次以上，培养至少3周(扩增期)。3周后收集培养上清，接种于野生型C8166细胞中培养7天后检测RCL标志物(指示期)。细胞培养法更为灵敏，假阴性结
果出现的概率低，但该方法需要使用阳性对照毒株。由于RCL的结构未知，检测时选择何种毒株作为阳性对照具有挑战性。国外有研究指出，使用缺乏辅助基因的HIV弱毒株可以作为RCL检测的阳性对照(如R8.71病毒)。
[0007]综上所述，目前的RCL阳性对照存在以下问题：(1)不便于快速检测，且定量灵敏度低；(2)现采用的弱毒株阳性对照与第三/四代包装系统中的转移序列序列不一致，存在系统差别，易出现假阴性，因此，提供一种有效的阳性对照，利于提高检测效率和准确性，且可适用于多种检测方法，对于RCL检测领域具有重要意义。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种用于复制型病毒检测的重组表达载体及其应用，本专利技术设计一种用于复制型病毒检测的重组表达载体，可用于制备复制型病毒，作为RCL检测的阳性对照品，利于提高检测效率、准确性和便捷性，且可适用于多种检测方法，检测结果更可靠，安全性更高。
[0009]为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供一种用于复制型病毒检测的重组表达载体，所述重组表达载体包括含有荧光蛋白的编码基因和疱疹性口腔炎病毒G蛋白的编码基因的病毒载体。
[0011]本专利技术中，在病毒载体中插入荧光蛋白的编码基因和疱疹性口腔炎病毒G蛋白(VSV
‑
G)的编码基因(VSVg)(可以选择VSVg部分序列即可)，利于快速检测，可进一步用于制备复制型病毒，作为RCL检测的阳性对照品，利于提高检测效率、准确性和便捷性，且可适用于多种检测方法，检测结果更可靠，安全性更高。
[0012]本专利技术中，本领域通用的用于荧光标记的荧光蛋白均适用于本专利技术，不作特殊限制。
[0013]优选地，所述荧光蛋白可选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白中任意一种或至少两种的组合。
[0014]本专利技术中，本领域通用的病毒载体均适用于本专利技术，不作特殊限制。
[0015]优选地，所述病毒载体可选自HIV载体。
[0016]优选地，所述病毒载体可选自pNL4
‑3‑
luci
‑
R
‑
E
‑
质粒。
[0017]优选地，所述绿色荧光蛋白的编码基因的核酸序列可以包括SEQ ID NO.1所示的序列。
[0018]SEQ ID NO.1：
[0019]atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于复制型病毒检测的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括含有荧光蛋白的编码基因和疱疹性口腔炎病毒G蛋白的编码基因的病毒载体。2.根据权利要求1所述的用于复制型病毒检测的重组表达载体，其特征在于，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述病毒载体选自HIV载体；优选地，所述疱疹性口腔炎病毒G蛋白的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.2所示的序列。3.根据权利要求2所述的用于复制型病毒检测的重组表达载体，其特征在于，所述病毒载体选自pNL4
‑3‑
luci
‑
R
‑
E
‑
质粒；优选地，所述绿色荧光蛋白的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列。4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求1
‑
3任一项所述的用于复制型病毒检测的重组表达载体；优选地，所述重组细胞由向宿主细胞中导入所述用于复制型病毒检测的重组表达载体制备得到。5.一种重组病毒，其特征在于，所述重组病毒含有权利要求1
‑
3任一项所述的用于复制型病毒检测的重组表达载体。6.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：狄升蒙，茅健，陈鑫，付姣，李照润，范艳秋，余学军，梁辉，
申请(专利权)人：华道上海生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：