一种RARG基因敲减稳转细胞株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种RARG基因敲减稳转细胞株及其构建方法与应用，RARG基因敲减稳转细胞株的构建方法包括：运用慢病毒表达载体和包装质粒在细胞中构建RARG稳定干扰细胞株，经过抗生素抗性筛选后建立可诱导干扰RARG的稳转细胞株。本发明专利技术的RARG基因敲减稳转细胞株能够用于制备动物模型、研发药物以及基因治疗，为RARG基因的功能研究提供平台，同时也为后续的基因治疗方法提供充足的理论依据。基因治疗方法提供充足的理论依据。基因治疗方法提供充足的理论依据。

【技术实现步骤摘要】
一种RARG基因敲减稳转细胞株及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及医学分子生物学
，具体来说，涉及一种RARG基因敲减稳转细胞株及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]卵巢癌是全球第三大常见的妇科恶性肿瘤，其致死率居妇科恶性肿瘤之首。2020年，全球有31万余卵巢癌确诊病例，死于卵巢癌者超过20万。随着饮食模式变化、育龄延迟和产次下降等潜在危险因素不断增加，卵巢癌防治成为我国的公共卫生问题，研究显示，中国卵巢癌年发病率和死亡率分别居女性生殖系统肿瘤第3位和第1位，中国卵巢癌的发病率在过去10年间增长了30％。
[0003]中国卵巢癌死亡率的持续增长可能主要是由于缺乏经济有效的筛查策略。卵巢癌高死亡率的主要因素之一就是缺乏有效的筛查策略，患者早期无明显的临床症状，70％以上的卵巢癌患者就诊时已为晚期，加之晚期生存率不高，故死亡率高。目前国内外尚无行之有效的筛查方法可降低卵巢癌的死亡率。卵巢癌标准治疗以手术治疗为主，辅以化学治疗、放射治疗及免疫治疗等。尽管化疗治疗卵巢癌的短期效果明显，但一部分患者在经过多次化疗后，对药物的敏感性降低，产生耐药性从而无法达到满意治疗的效果。早诊困难和化疗耐药是导致晚期卵巢癌预后差的主要原因。因此针对这一现状，需要开发新的针对卵巢癌患者的治疗策略，亟需靶向治疗、免疫治疗及其相关联合治疗等替代治疗方式的革新。靶向治疗是指利用单克隆抗体或小分子化合物对肿瘤细胞的分子靶点进行特异性干扰以达到抗肿瘤目的，主要包括抗血管生成治疗、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADPr/>‑
ribose polymerase,PARP)抑制剂治疗及免疫检查点抑制剂治疗等。目前抗血管生成治疗存在不可避免的副作用，包括高血压、贫血、血小板减少等血液学毒性。因此，发现新的卵巢癌治疗靶点是临床中亟待解决的科学问题。
[0004]在前期工作中，我们联合TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中的转录组数据和ICGC(International Cancer Genome Consortium)数据库中的卵巢癌组织数据分析发现，目前，我们前期通过生物信息学对TCGA数据库进行数据分析，发现与卵巢正常组织相比，RARG基因在卵巢癌中的mRNA表达量高(P<0.05)，且其表达量与卵巢癌分期有关，晚期卵巢癌的RARG mRNA表达量明显高于早期(P<0.05)。进一步，我们选择了3个卵巢癌组织和3个配对的正常卵巢组织进行免疫组化IHC实验，发现相比于正常卵巢组织，卵巢癌组织中显著高表达RARG，差异具有统计学意义(P<0.001)。
[0005]关于RARG的研究由来已久，最近几年越来越多的研究显示RARG与肿瘤的发生发展密切相关。然而，目前的研究结果表明RARG在不同的肿瘤中扮演着不同的角色，可能是抑癌基因，也可能是癌基因。一方面，RARG可能作为癌基因促进肿瘤细胞的增殖和迁移。例如，在胆管癌中RARG过表达能够激活Akt/NF
‑
κB和Wnt/β
‑
catenin信号通路，从而增强癌细胞的增殖和迁移能力。同样，RARG在肝癌组织中表达升高，RARG表达上调能够激活PI3K/Akt信号通路和NF
‑
κB信号通路，增加癌细胞的恶性程度。另一方面，RARG也被报道为抑制癌细胞增殖
和侵袭的肿瘤抑制因子。例如，RARG通过调节碳水化合物转移酶10的表达，可以抑制黑色素瘤的侵袭能力。RARG在结直肠癌组织中表达降低，揭示了RARG可以作为抑癌基因，通过抑制Hippo
‑
Yap信号通路调节结直肠肿瘤的发生和转移。
[0006]基于此，本专利技术利用特定干扰序列，通过重组慢病毒的方法敲除卵巢癌细胞中RARG基因的表达，构建了稳转细胞株。本专利技术获得RARG基因稳定敲除的卵巢癌细胞能够用于制备动物模型、研发药物以及基因治疗，为RARG基因的功能研究提供平台，同时也为后续的基因治疗方法提供充足的理论依据。

技术实现思路

[0007]针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种RARG基因敲减稳转细胞株及其构建方法与应用，能够克服现有技术的上述不足。
[0008]为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0009]一种RARG基因敲减稳转细胞株的构建方法，该方法包括：运用慢病毒表达载体和包装质粒在细胞中构建RARG稳定干扰细胞株，经过抗生素抗性筛选后建立可诱导干扰RARG的稳转细胞株。
[0010]进一步地，所述细胞株为A2780细胞或SKOV3细胞。
[0011]进一步地，所述慢病毒表达载体为pLKO.1
‑
RARG。
[0012]根据本专利技术的另一方面，提供了一种由所述构建方法得到的RARG基因敲减稳转细胞株。
[0013]本专利技术还提供了所述RARG基因敲减稳转细胞株在建立卵巢癌动物模型及制备治疗卵巢癌的药物中的应用。
[0014]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种可以有效抑制卵巢癌克隆能力和增殖能力的分子标志物，该标志物有以下特征：在卵巢癌组织中高表达，而在正常卵巢组织中不表达，高表达的卵巢癌患者，其术后生存期短。本专利技术构建的RARG基因敲减稳定转染细胞株对进一步探索卵巢癌新型靶点具有重要意义。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1A是卵巢癌组织与卵巢正常组织中的RARG mRNA表达量对比图；
[0017]图1B是晚期卵巢癌(III
‑
IV期)组织与早期卵巢癌(I
‑
II期)组织中的RARG mRNA表达量对比图；
[0018]图1C是RARG的mRNA低表达组与高表达组的生存曲线；
[0019]图1D是ROC曲线；
[0020]图1E是单因素和多因素Cox分析结果之一；
[0021]图1F是单因素和多因素Cox分析结果之二；
[0022]图1G是RARG的DNA拷贝数变异分析结果；
[0023]图2是卵巢癌组织与卵巢正常组织中RARG的mRNA表达水平对比图；
[0024]图3是A2780细胞RARG
‑
sh组与Non
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silence组的蛋白表达量对比图；
[0025]图4是A2780细胞RARG
‑
sh组与Non
‑
silence组的细胞克隆数量对比图；
[0026]图5是A2780细胞RARG
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sh组与Non
‑
silence组的增殖生长对比图；
[0027]图6A是A2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RARG基因敲减稳转细胞株的构建方法，其特征在于，包括：运用慢病毒表达载体和包装质粒在细胞中构建RARG稳定干扰细胞株，经过抗生素抗性筛选后建立可诱导干扰RARG的稳转细胞株。2.根据权利要求1所述的RARG基因敲减稳转细胞株的构建方法，其特征在于，所述细胞株为A2780细胞或SKOV3细胞。3.根据权利要求1所述的RARG基因敲减稳转细胞株的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：修琳，吴令英，李宁，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：