一种复杂食品基质中虾原肌球蛋白的定量检测方法技术

本发明专利技术公开一种复杂食品基质中虾原肌球蛋白的定量检测方法，所述方法为：在待测食品样品中加入同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，经过蛋白提取、胰蛋白酶消化成多肽、净化样品后经UPLC

【技术实现步骤摘要】
一种复杂食品基质中虾原肌球蛋白的定量检测方法


[0001]本专利技术属于食品安全检测
，具体涉及一种复杂食品基质中虾原肌球蛋白的定量检测方法。

技术介绍

[0002]在食品安全领域，过敏患者主要通过避免摄入过敏原以达到保护健康的目的，因此基于食品标签管理的目的，需要对食物内过敏原这类特殊蛋白进行定量。此外，在生物医学领域，当蛋白质作为诊断标记物时，在特定组织、靶器官内的含量与疾病的严重程度挂钩，准确的蛋白定量方法可以准确反映疾病进程的状态。常用的蛋白质检测方法分为基因学检测、免疫学检测和质谱检测三种，其中基因学检测和免疫学检测受复杂基质影响较大，常用于定性检测。
[0003]使用质谱方法定量蛋白质的基本策略是将样品中目的蛋白通过胰蛋白酶酶解成肽段后，使用LC
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MS/MS对1条或者多条肽段定量，继而通过计算完成对蛋白质的定量。在这一过程中，影响定量准确性的主要因素是未知的酶解效率和复杂的基质效应。现在常用的同位素稀释质谱定量法主要是AQUA，其通过在酶解后的样品中添加同位素重链肽段，再由质谱分析获得肽段非同位素轻链和同位素重链的峰面积比进行定量。这一方法可以在肽段层面完成准确定量，但回溯到蛋白这一步的过程则由于添加的重链肽段不参与酶解，无法校正这一过程产生的损失。因此，使用与目标蛋白氨基酸序列类似的同位素重标蛋白作为内标，与目的蛋白同时参与酶解、净化等过程，可以校正这些步骤产生的误差，提高质谱定量的灵敏度和准确性。
[0004]专利文献CN 114578065 A公开一种用于定量的同位素标记的完整蛋白的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：重组质粒的制备；重组蛋白的表达；蛋白性能验证；蛋白纯化；蛋白纯度检测；蛋白定量。该技术使用
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C标记的葡萄糖作为大肠杆菌扩大培养唯一的营养来源，表达的蛋白为
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C标记的蛋白。缺陷在于，该技术的成本很高，因为同位素
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C来自培养基内额外添加的葡萄糖，葡萄糖不仅参与目标蛋白的合成，还参与细胞的其他生理活动，所以该方法将会消耗大量
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C标记的葡萄糖，导致标记成本很高。该技术对重组表达的蛋白中所有的C原子进行同位素标记，普适性好，但稳定性并不高，并且大量标记会出现同位素覆盖率较低的缺陷，影响检测结果。
[0005]在所有过敏原案例中，由虾原肌球蛋白（TM）导致的约占 16.1%。在中国，研究报告显示虾原肌球蛋白是最危害成年人健康的食物过敏原之一。本专利技术针对虾原肌球蛋白提出一种使用全长同位素标记的重组蛋白作为内标对复杂食品基质中的虾原肌球蛋白进行准确的UPLC
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MS/MS 定量分析方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术的一个目的是提供一种复杂食品基质中的虾原肌球蛋白含量检测方法，所述检测方法以全长同位素标记的重组虾原肌球蛋白作为内标，建立UPLC
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MS/MS定量分析方
法；本专利技术另一个目的是提供一种所述全长同位素标记的重组虾原肌球蛋白的制备方法；本专利技术还有一个目的是提供一种所述全长同位素标记的重组虾原肌球蛋白在检测食品中天然虾原肌球蛋白的用途。
[0007]本专利技术的目的通过上述技术方案实现：第一方面，本专利技术提供一种食品中虾原肌球蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述方法为：在待测食品样品中加入同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，经过蛋白提取、胰蛋白酶消化成多肽、净化样品后经UPLC
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MS/MS分析，通过非标记的特征肽段与同位素标记的特征肽段峰面积比计算得到待测样品中虾原肌球蛋白的含量。
[0008]所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白是将重组全长虾原肌球蛋白（氨基酸序列如SEQ ID NO:1）中的赖氨酸和精氨酸进行同位素标记，具体是将赖氨酸（K）和精氨酸（R）中的
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C和
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N标记为
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C和
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N。
[0009]本专利技术所述的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白通过如下方法制备得到：（A）将大肠杆菌载体中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因敲除，构建大肠杆菌缺失株；（B）将虾原肌球蛋白目的基因（SEQ ID NO:2）与表达质粒连接，转染进大肠杆菌缺失株感受态细胞中；（C）挑取阳性转染细胞，在含有
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C
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N
‑
赖氨酸和
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C
15
N
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精氨酸的培养基中进行培养，诱导蛋白表达；（D）破碎菌体，取上清液与镍柱结合，分离纯化得到同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白。
[0010]在本专利技术的具体实施方式中，所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白的制备方法如下：S1: 构建大肠杆菌缺失株用CRISPR将大肠杆菌工程株BL21(DE3)中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因lysA、argA敲除，获得大肠杆菌赖氨酸
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精氨酸缺失株（E.coliBL21(DE3)Δlys Δarg），并使用氯化钙法将其制备为感受态细胞；S2:构建原核表达载体将表达虾原肌球蛋白的目的基因与表达质粒连接，转染进感受态细胞大肠杆菌赖氨酸
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精氨酸缺失工程株内，通过菌液PCR和二代测序确认插入序列的正确性；S3:蛋白的表达将插入序列正确的阳性克隆使用LB培养基传代，转入M9液体培养扩增菌种，加入IPTG诱导表达蛋白，所述培养基中均添加
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C
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N
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赖氨酸和
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C
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N
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精氨酸；S4:蛋白的分离纯化超声破碎菌体，取菌体上清液与镍柱结合，通过重组蛋白的His标签与镍柱的特异性结合分离纯化得到同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白。
[0011]本专利技术所述的特征肽段选自IVELEEELR、ALSNAEGEVAALNR、LAEASQAADESER、LAMVEADLER、MDALENQLK、FLAEEADR、ANIQLVEK中的一种或两种以上的组合。
[0012]优选的，所述特征肽段选自IVELEEELR、ALSNAEGEVAALNR、LAEASQAADESER中的一种或两种以上的组合。
[0013]在本专利技术的最优选实施方式中，所述特征肽段为IVELEEELR。
[0014]本专利技术所述的待测食品样品包括所有可能含有虾原肌球蛋白的食品，例如膨化食品、鱼糜制品、酱类食品，具体包括但不限于虾片、玉米片、香菇猪肉丸、虾球、生虾、鸡肉丸、沙茶酱、辣椒酱。
[0015]在本专利技术的具体实施方式中，所述食品中虾原肌球蛋白的定量检测方法包括如下步骤：（1）制作标准曲线；（2）将待检测食品粉碎制备成待检样品，加入本专利技术制备的同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，加入蛋白提取液超声提取20
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30min，离心，取上清；（3）加入胰蛋白酶对上清液中的蛋白进行酶解；（4本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食品中虾原肌球蛋白的定量检测方法，其特征在于，所述方法为：在待测食品样品中加入同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，经过蛋白提取、胰蛋白酶消化成多肽、净化样品后经UPLC
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MS/MS分析，通过非标记的特征肽段与同位素标记的特征肽段峰面积比计算得到待测样品中虾原肌球蛋白的含量；所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白是将重组全长虾原肌球蛋白中的赖氨酸和精氨酸进行同位素标记，具体是将赖氨酸和精氨酸中的
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C和
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N标记为 13C
和
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N；所述特征肽段选自IVELEEELR、ALSNAEGEVAALNR、LAEASQAADESER、LAMVEADLER、MDALENQLK、FLAEEADR、ANIQLVEK中的一种或两种以上的组合。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白通过如下方法制备得到：（A）将大肠杆菌载体中与赖氨酸和精氨酸合成相关的基因敲除，构建大肠杆菌缺失株；（B）将虾原肌球蛋白目的基因与表达质粒连接，转染进大肠杆菌缺失株感受态细胞中；（C）挑取阳性转染细胞，在含有
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C
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N
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赖氨酸和
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C
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N
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精氨酸的培养基中进行培养，诱导蛋白表达；（D）破碎菌体，取上清液与镍柱结合，分离纯化得到同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述特征肽段选自IVELEEELR、ALSNAEGEVAALNR、LAEASQAADESER中的一种或两种以上的组合。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述特征肽段为IVELEEELR。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述食品中虾原肌球蛋白的定量检测方法包括如下步骤：（1）制作标准曲线；（2）将待检测食品粉碎制备成待检样品，加入同位素标记的重组全长虾原肌球蛋白作为内标，加入蛋白提取液超声提取20
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30min，离心，取上清；（3）加入胰蛋白酶对上清液中的蛋白进行酶解；（4）将酶解后的肽段样品使用HLB premium 3cc柱进行净化，将净化后的样品转移至进样小瓶；（5）使用UPLC
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MS/MS进行分析，根据非标记的特征肽段与同位素标记的特征肽段峰面积比，带入标准曲线中计算得到待测样品中虾原肌球蛋白的含量。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线的制作方法选自如下两个方案中的一种或两种的组合：方案1：使用天然虾原肌球蛋白配制0.2 μg/ml、0.5 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、5 μg/ml、10μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/mL 9个梯度的标准工作溶液，加入终浓度为20μg/ml的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李会，邵兵，吴一戈，吴萱，
申请(专利权)人：北京市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：