一种区别不同基原桑黄类真菌的方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种区别不同基原桑黄类真菌的方法与应用。本发明专利技术所述方法为：将桑黄样品预处理；用UPLC

【技术实现步骤摘要】
一种区别不同基原桑黄类真菌的方法与应用


[0001]本专利技术涉及桑黄基原鉴定的
，尤其涉及一种区分不同基原桑黄类真菌的方法与应用。

技术介绍

[0002]桑黄是我国著名的药用真菌，最早源于我国汉代的《神农本草经》。其中记载“桑耳，黑者，主女子漏下赤白汁，血病癥瘕积聚，阴痛，阴阳寒热无子。五木耳，名檽，益气不饥，轻身强志。生山谷。”现代药理学研究表明，其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖等多种活性。民间常用的桑黄类真菌包括桑黄孔菌属(Sanghuangporus)、纤孔菌属(Inonotus)和热带孔菌属(Tropicoporus)的多个种，由于外观相似且不易通过性状进行鉴定，市场上基原混淆严重。
[0003]桑黄类真菌可生长于桑树、杨树、柳树、栎树等多种树木上，生长于桑树上的只有桑树桑黄一种，药用价值高，但是野生资源稀缺。由于生长环境的多样性，不同种桑黄类真菌的化学成分和药理活性均有较大差异，市场经济价值也有较大差异。目前桑黄的基原鉴定多通过性状鉴别或者ITS鉴定。性状鉴别虽然简便易行，但多依靠经验，缺乏明确的判断标准。ITS鉴定通过提取样本DNA进行扩增测序后，与数据库中已知序列进行比对进行鉴定，准确性较高，但操作繁琐；且野生桑黄多木质化，DNA提取困难。因此探索一种简便直观的方法实现不同基原桑黄的区分具有重要意义。
[0004]质谱分子网络(molecular networking，MN)根据结构相似的天然产物分子产生相似的碎片离子，通过检索数据库和设定二级碎片的相似度阈值将所采集的质谱数据整合为一张可视化的分子网络图，每个节点代表一个碎片离子，结构相似的化合物会聚集成分子簇并以线(边)相互连接。由于不同基原的桑黄存在化学成分的差异性，其分子网络图所呈现的节点、分子簇和边均会有所不同。经典的质谱分子网络构建中采用DDA(数据依赖采集模式)进行数据采集，即在进行一级质谱分析后，根据设定的筛选条件筛选母离子进行二级质谱分析，可获得更多的碎片信息。该方法筛选目标离子采用的窗口较窄，在一定上可减少干扰离子的存在，但会造成部分信息的缺失。基于特征的质谱分子网络(feature
‑
based molecular networking，FBMN)采用DIA(数据非依赖采集模式)进行数据采集，通过高低碰撞能量进行一级质谱和碎片信息的交替采集，不需要对母离子进行筛选，利用若干个窗口对质谱进行全范围扫描，对每个窗口中的所有离子进行快速、循环选择和检测，理论上可以获得样本中所有离子的全部碎片信息，提高了数据利用度，缺失值更少，分析重复性更高。在构建可视化分子网络的同时，FBMN能够实现对目标成分的相对定量分析。近年来，MN广泛应用于天然产物的发现与鉴定领域，尚未有FBMN在桑黄类真菌基原鉴定方面的研究和应用。

技术实现思路

[0005]本申请针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种区分不同基原桑黄类真菌的方法
与应用。本专利技术利用基于特征的质谱分子网络技术区分不同基原桑黄类真菌，所述方法可以建立每种桑黄类真菌的可视化图形，同时能够直观快速区分不同基原的桑黄类真菌，还可以对区分每种组分在不同基原桑黄类真菌中的含量，为桑黄的基原鉴定及成分的利用提供了一种新的思路和方法。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术首先保护一种区别不同基原桑黄类真菌的方法，所述方法如下：
[0008](1)桑黄样品前处理；
[0009](2)采用UPLC
‑
Q
‑
TOF
‑
MSE(超高效液相色谱单四级杆飞行时间串联质谱仪联用系统)进行DIA(数据非依赖模式采集)数据采集；
[0010](3)将步骤(2)采集的数据分别进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化(每种基原桑黄的数据分别导入处理)，得到每个桑黄的分子网络图形作为标准图形。
[0011](4)将步骤(2)采集的不同基原桑黄的数据同时进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化(将所有待测桑黄的数据同时导入处理)，得到桑黄样品的分子网络图形；
[0012](5)对比步骤(4)得到的分子网络图形与每个桑黄样品的分子网络图形，判断是否属于同一种桑黄类真菌，如果分子网络图形相同，则属于同一种桑黄类真菌；否则就不属于同一种桑黄类真菌。
[0013]进一步地，所述不同基原是指不同物种，即不同桑黄菌种。
[0014]进一步地，步骤(1)中，所述桑黄包括桑树桑黄Sanghuangporus Sanghuang、杨树桑黄Sanghuangporus vaninii、暴马桑黄Sanghuangporus baumii中的一种或多种。
[0015]进一步地，步骤(1)中，所述样品前处理的方法为：分别将不同基原的桑黄粉碎得到桑黄粉末，加入溶剂进行超声处理，得到桑黄样品。
[0016]进一步地，步骤(1)中，所述桑黄粉末与溶剂的质量体积比为0.01
‑
0.05g：1mL，所述桑黄粉末与溶剂的质量体积比优选0.02g：1mL；所述溶剂为甲醇；所述超声的时间为10
‑
60min，所述超声的时间优选30min。
[0017]进一步地，步骤(2)中，所述UPLC
‑
Q
‑
TOF
‑
MSE中超高效液相色谱的色谱柱为硅胶基反相超高效液相色谱柱，优选地，所述UPLC
‑
Q
‑
TOF
‑
MSE中超高效液相色谱的色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，100mm
×
2.1mm,1.7μm；流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈。
[0018]进一步地，所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.1
‑
0.5％，超高效液相色谱采用梯度洗脱，流速为0.25
‑
0.4mL/min，进样体积为5
‑
10μL；所用色谱柱的柱温为30
‑
40℃。
[0019]进一步地，所述洗脱梯度的方法如下：0
‑
3min，5％流动相B；3
‑
5min，5％
→
15％流动相B(流动相B的比例由5％变为15％)；5
‑
9min，15％流动相B；9
‑
15min，15％
→
25％流动相B(流动相B的比例由15％变为25％)；15
‑
28min，25％
→
80％流动相B(流动相B的比例由25％变为80％)；28
‑
28.1min，80％
→
5％流动相B(流动相B的比例由80％变为5％)；28.1
‑
30min，5％流动相B。
[0020]进一步地，优选条件为：采用Waters ACQUITY UPLC BEH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种区别不同基原桑黄类真菌的方法，其特征在于，所述方法如下：(1)桑黄样品前处理；(2)采用UPLC
‑
Q
‑
TOF
‑
MSE进行数据非依赖模式采集数据；(3)将步骤(2)采集的数据进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化，得到每个桑黄的分子网络图形作为标准图形；(4)将步骤(2)采集的不同基原桑黄的数据同时进行基于特征的质谱分子网络构建及可视化，得到桑黄样品的分子网络图形；(5)对比步骤(4)得到的分子网络图形与步骤(3)得到的每个桑黄样品的分子网络图形，判断是否属于同一种桑黄类真菌，如果分子网络图形相同，则属于同一种桑黄类真菌；否则就不属于同一种桑黄类真菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述桑黄包括桑树桑黄、杨树桑黄、暴马桑黄中的一种以上。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述样品前处理的方法为：将桑黄样品粉碎得到桑黄粉末，加入溶剂进行超声处理，得到桑黄样品。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述桑黄粉末与溶剂的质量体积比为0.01
‑
0.05g：1mL，所述桑黄粉末与溶剂的质量体积比优选0.02g：1mL；所述溶剂为甲醇；所述超声的时间为10
‑
60min，所述超声的时间优选30min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述UPLC
‑
Q
‑
TOF
‑
MSE中超高效液相色谱的色谱柱为硅胶基反相超高效液相色谱柱，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述甲酸水溶液中甲酸的体积浓度为0.1
‑
0.5％，超高效液相色谱采用梯度洗脱，流速为0.25
‑
0.4mL/min，进样体积为5
‑
10μL；所用色谱柱的柱温为30
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张梁，李默影，顾正华，庞欣，辛瑜，郭自涛，李由然，丁重阳，石贵阳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：