靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin16的CAR载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体及其构建方法和应用，所述CAR载体包括嵌合抗原受体和载体，所述嵌合抗原受体连接在载体上，所述嵌合抗原受体包括Claudin 16单链抗体的特异性结构，所述Claudin 16单链抗体特异性结构由VH、VL以及连接VH和VL的柔性Linker构成。所述嵌合抗原受体的结构为SP

【技术实现步骤摘要】
靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药免疫细胞
，具体涉及一种靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，发病率居女性生殖系统恶性肿瘤第三位，但死亡率却高居首位。由于发病隐匿，早期症状不明显，70％的患者确诊时已至临床晚期，错失手术根治机会，因此，卵巢癌也被称为“沉默杀手”。过去几十年，我国卵巢癌临床治疗方式仍以三大常规治疗为主，70％患者经初治后1
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2年内复发，甚至多次复发，总体5年生存率一直徘徊在30％左右，未见明显提升。近年来，随着免疫治疗的兴起，各种免疫疗法也纷纷涉足卵巢癌，力求控制“沉默杀手”的进展，改变卵巢癌获益不佳的临床治疗格局。半个多世纪以来，癌症的治疗很大程度上依赖于放射治疗、外科手术、化疗以及以肿瘤基因组中特异突变为靶向的药物(越来越多地被使用)。虽然这些常规疗法对很多患者有效，但是目前还是急需开发新型疗法。利用免疫系统的特异能力来识别并摧毁肿瘤细胞是对抗癌症的一种新方法，即免疫疗法。卵巢癌是一种典型的免疫抑制型肿瘤，所以，科学家相信卵巢癌患者可以获益于免疫治疗。
[0003]嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是癌症免疫疗法中的一种。这类疗法是通过抽取患者自身的T细胞并给它们配备一个靶向癌细胞的受体、在专门的设备中大量生产嵌合抗原受体T细胞、然后注入病人体内，以达到摧毁肿瘤细胞的目的。由于CAR/>‑
T疗法的高灵敏度，和传统抗体药物相比，其靶向/脱靶毒性会导致更为严重的毒副作用。因此，CAR
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T治疗的靶点选取不能套用传统抗体治疗的靶点选取标准，而是需要寻找更为严格的肿瘤特异性抗原作为靶点。
[0004]因此，本专利技术首次将Claudin 16作为CAR
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T治疗的靶点，本专利技术提供的能靶向Claudin 16的CAR载体既可以识别Claudin 16阳性表达的卵巢癌细胞，又可以增强T淋巴细胞的杀伤能力，从而提高CAR
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T免疫疗法抗卵巢癌的效果。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术存在的缺陷，本专利技术提供了能靶向Claudin 16的特异性的CAR载体、其构建方法及应用。本专利技术提供的能靶向Claudin 16的CAR载体既可以识别Claudin 16阳性表达的卵巢癌细胞，又可以增强T淋巴细胞的杀伤能力，从而提高CAR
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T免疫疗法抗卵巢癌的效果。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
[0007]本专利技术的第一目的提供一种靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体，其包含编码嵌合抗原受体的基因，
[0008]所述嵌合抗原受体用于靶向卵巢癌细胞特异性高表达的蛋白Caudin 16，
[0009]所述嵌合抗原受体的结构为SP
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Claudin 16 scFv
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TM
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CD28
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1BB
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CD3ζ，其中，SP为引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的信号肽，Claudin 16scFv为特异性识别细胞表面Claudin 16的单链抗体，TM为连接胞外抗原结合域和胞内信号域的跨膜结构域，CD28
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1BB为共刺激信号分子，CD3ζ为胞浆信号转导域。
[0010]优选的，所述Claudin 16scFv包括重链可变区VH、轻链可变区VL、以及连接重链可变区VH和轻链可变区VL的柔性连接链，所述重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述柔性连接链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]优选的，所述重组载体为包含编码嵌合抗原受体的基因的重组载体、慢病毒包装质粒及包膜质粒。
[0012]优选的，所述重组载体为GV230
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Claudin 16scFv。
[0013]本专利技术的第二目的提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有如上所述的载体或染色体中整合有外源的如上所述的核酸分子。
[0014]本专利技术的第三目的提供一种获得靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR
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T细胞的方法，将如上所述的重组载体经慢病毒包装获得高滴度的慢病毒，用该慢病毒感染T细胞，获得嵌合抗原受体
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T细胞。
[0015]优选的，所述慢病毒包装采用293T细胞作为包装细胞，并采用三质粒包装系统，所述三质粒包装系统包括PSPAX2质粒、pMD2G质粒和重组载体，所述PSPAX2质粒、pMD2G质粒和重组载体的质量比为5:3:3。
[0016]本专利技术的第四目的提供一种如上所述的嵌合抗原受体、如上所述的核酸分子、如上所述的载体、或如上所述的细胞的用途，用于制备治疗卵巢癌的药物或制剂。
[0017]本专利技术的第五目的还提供了一种靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体的构建方法，
[0018]步骤如下：
[0019](1)将所述嵌合抗原受体保存在PEE6.4质粒上；
[0020](2)将含有步骤(1)中PEE6.4质粒和慢病毒载体进行双酶切，将酶切产物分别经过琼脂糖凝胶电泳分离，获得双酶切后的含有嵌合抗原受体的目的片段和双酶切后慢病毒载体；
[0021](3)将步骤(2)中的含有嵌合抗原受体的目的片段和步骤(2)中的慢病毒载体进行连接，将连接产物进行转化，提取质粒，获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，所述重组质粒为靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体。
[0022]优选的，所述步骤(2)中的双酶切为XoHI和BamHI，所述步骤(3)中含有嵌合抗原受体的目的片段和慢病毒载体连接的质量比为10:1。
[0023]本专利技术相较于现有技术，具有以下有益效果：
[0024]本专利技术提供了靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体的结构及构建方法，其结构中包含独特的claudin 16单链抗体；
[0025]Claudin 16单链抗体是根据Claudin 16在卵巢癌的组织中高表达作为靶点而确定的特异性结构，一方面可靶向性结合卵巢癌细胞；另一方面，赋予T细胞新的抗原特异性，可有效避免肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制。当T细胞通过病毒感染方式获得该载
体并表达该CAR结构后，T细胞即可靶向性识别并杀伤卵巢癌细胞。本专利技术首次将Claudin 16作为CAR
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T治疗的靶点，本专利技术提供的能靶向Claudin 16的CAR载体既可以识别Claudin 16阳性表达的卵巢癌细胞，又可以增强T淋巴细胞的杀伤能力，从而提高CAR
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体，其包含编码嵌合抗原受体的基因，其特征在于，所述嵌合抗原受体用于靶向卵巢癌细胞特异性高表达的蛋白Caudin 16，所述嵌合抗原受体的结构为SP
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Claudin 16scFv
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TM
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CD28
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1BB
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CD3ζ，其中，SP为引导新合成的蛋白质进行跨膜转移的信号肽，Claudin 16scFv为特异性识别细胞表面Claudin 16的单链抗体，TM为连接胞外抗原结合域和胞内信号域的跨膜结构域，CD28
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1BB为共刺激信号分子，CD3ζ为胞浆信号转导域。2.根据权利要求1所述的靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体，其特征在于，所述Claudin 16scFv包括重链可变区VH、轻链可变区VL、以及连接重链可变区VH和轻链可变区VL的柔性连接链，所述重链可变区VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述轻链可变区VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述柔性连接链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.根据权利要求1所述的靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体，其特征在于，所述重组载体为包含编码嵌合抗原受体的基因的重组载体、慢病毒包装质粒及包膜质粒。4.根据权利要求3所述的靶向卵巢癌细胞特异性高表达蛋白Claudin 16的CAR载体，其特征在于，所述重组载体为GV230
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Claudin 16scFv。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有如权利要求3所述的载体或染色体中整合有外源的如权利要求2所述的核酸分子。...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷霞，庄光磊，卢淮武，周颖，张振峰，周小进，
申请(专利权)人：苏州仁端生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：