本发明专利技术提供了一种提高NK细胞慢病毒转导效率的方法,属于细胞转导技术领域。本发明专利技术针对NK细胞外源基因转导的瓶颈问题,用编码BaEV糖蛋白序列替换慢病毒表面本身的包膜蛋白VSVG蛋白,利用BaEV胞膜糖蛋白能特异性结合N细胞膜上的ASCT2,提高NK细胞慢病毒转导效率,同时将NK细胞诱导成记忆样NK细胞进一步提高了原代NK细胞的慢病毒转导效率,因此本发明专利技术提供的方法实现了对天然免疫细胞的稳定基因修饰,为肿瘤免疫治疗提供了基础。为肿瘤免疫治疗提供了基础。为肿瘤免疫治疗提供了基础。
【技术实现步骤摘要】
一种提高NK细胞慢病毒转导效率的方法
[0001]本专利技术属于细胞转导
,具体涉及一种提高NK细胞慢病毒转导效率的方法。
技术介绍
[0002]目前,以免疫检查点抑制剂为代表的肿瘤免疫治疗为部分肿瘤患者带来显著生存获益,然而大部分患者对其反应不佳或存在原发性抵抗
[1]。因此,全球正在加快研发各种新的免疫治疗手段。嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)免疫细胞,作为一种基因工程化免疫细胞治疗方法,能够精准、快速、高效地杀灭肿瘤,成为一种极具前景的新型肿瘤免疫治疗方法
[2]。目前,经CAR修饰的T细胞(CAR
‑
T)已经在血液恶性肿瘤中获得惊人的疗效,然而,因肿瘤特异性抗原靶点的选择、受限的肿瘤内浸润、肿瘤内免疫抑制性微环境、肿瘤细胞异质性这些因素限制了基于CAR的基因工程化免疫细胞在恶性实体瘤治疗中的临床应用
[3]。CAR
‑
NK细胞因为具有更高安全性、多重靶细胞杀伤途径、易制备通用型细胞产品等独特生物学优势使它具有更广阔前景及巨大临床价值的免疫治疗手段
[4]。然而,当前CAR
‑
NK细胞的临床转化应用仍然面临基因修饰难度大的问题
[4]。因此,研发一套能够高效进行NK细胞基因修饰的技术是当前CAR
‑
NK细胞实现有效临床转化应用的技术瓶颈。
[0003]当前,有多种外源基因导入办法,包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、转座子技术及各种瞬时表达技术等。目前针对原代NK细胞的临床研究(包括新英格兰医学杂志最新报道的CAR
‑
NK细胞临床研究
[5])几乎用的是逆转录病毒或者瞬时表达技术
[4];然而,逆转录病毒更容易导致宿主基因插入突变,这种风险很大程度上限制了其临床应用
[6]。慢病毒是比较理想的基因导入技术,可将外源基因整合至宿主基因组高效稳定地表达,且导致宿主基因插入突变的风险低。目前基因转导所用慢病毒通常使用VSV
‑
G作为包膜蛋白,因为VSV
‑
G包膜蛋白对多种物种和细胞类型具有广泛的取向性。然而,NK细胞是天然免疫细胞,对慢病毒存在天然的抵抗及清除机制,慢病毒对NK细胞的转导效率通常仅有3%左右,远远无法满足临床的需求。
[0004]参考文献:
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技术实现思路
[0011]有鉴于此,本专利技术的目的在于提供一种提高NK细胞慢病毒转导效率的方法,可达到50%以上的转导效率。
[0012]本专利技术提供了一种提高NK细胞慢病毒转导效率的方法,包括以下步骤:
[0013]1)构建含编码BaEV糖蛋白序列的慢病毒包装质粒;
[0014]2)构建含CAR结构序列的慢病毒表达质粒;
[0015]3)将步骤1)中所述含BaEV糖蛋白的慢病毒包装质粒、步骤2)中含CAR结构序列的慢病毒表达质粒和pCMV
‑
dR8.9质粒在转染试剂作用下转染细胞,经培养收集表达BaEV糖蛋白和CAR的慢病毒;
[0016]4)将步骤3)中所述表达BaEV糖蛋白和CAR的慢病毒转导NK细胞,得到表达CAR的NK细胞;
[0017]步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。
[0018]优选的,步骤4)所述NK细胞包括原代NK细胞和NK92细胞株。
[0019]优选的,所述原代NK细胞包括记忆样NK细胞。
[0020]优选的,所述记忆样NK细胞的诱导方法,包括将原代NK细胞在含细胞因子的NK扩增培养基中进行刺激;所述细胞因子包括10ng/ml rhIL
‑
12、50ng/ml rhIL
‑
15和50ng/ml rhIL
‑
18。
[0021]优选的,步骤4)中所述转导的方法为用MOI=10的病毒滴度转导106个NK细胞。
[0022]优选的,步骤1)中所述构建含编码BaEV糖蛋白序列的慢病毒包装质粒的方法,将密码子优化的编码BaEV糖蛋白序列通过同源重组技术插入pCMV质粒中,所述密码子优化的编码BaEV糖蛋白序列如本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种提高NK细胞慢病毒转导效率的方法,其特征在于,包括以下步骤:1)构建含编码BaEV糖蛋白序列的慢病毒包装质粒;2)构建含CAR结构序列的慢病毒表达质粒;3)将步骤1)中所述含BaEV糖蛋白的慢病毒包装质粒、步骤2)中含CAR结构序列的慢病毒表达质粒和pCMV
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dR8.9质粒在转染试剂作用下转染细胞,经培养收集表达BaEV糖蛋白和CAR的慢病毒;4)将步骤3)中所述表达BaeV糖蛋白和CAR的慢病毒转导NK细胞,得到表达CAR的NK细胞;步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序的限制。2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤4)所述NK细胞包括原代NK细胞和NK92细胞株。3.根据权利要求2所述方法,其特征在于,所述原代NK细胞包括记忆样NK细胞。4.根据权利要求3所述方法,其特征在于,所述记忆样NK细胞的诱导方法,包括将原代NK细胞在含细胞因子的NK扩增培养基中进行刺激;所述细胞因子包括10ng/ml rhIL
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12、50ng/ml rhIL
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15和50ng/ml rhIL
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18。5.根据权利要求1所述方法,其特征在于,步骤4)中所述转导的...
【专利技术属性】
技术研发人员:谢国柱,张晗,
申请(专利权)人:南方医科大学南方医院,
类型:发明
国别省市:
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