帕金森基因编辑猪神经干细胞模型、构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了帕金森基因编辑猪神经干细胞模型、构建方法及应用。该重编的猪神经干细胞系不仅能够在细胞核中过表达SNCA和LRR，而且SNCA和LRR的表达相互无干扰。该猪神经干细胞模型具有神经干细胞的典型特征和分化功能，具有稳定的传代性能和分化性能。并且通过细胞实验证实了，其能够既能够被铁盐激活LRRK2功能，具有作为作用于LRRK2的相关药物筛选的细胞模型的用途，还能够过作为作用于SNCA基因表达的相关药物筛选的细胞模型的用途。达的相关药物筛选的细胞模型的用途。达的相关药物筛选的细胞模型的用途。

【技术实现步骤摘要】
帕金森基因编辑猪神经干细胞模型、构建方法及应用


[0001]本专利技术涉及帕金森基因研究的细胞模型
，尤其涉及帕金森基因编辑猪神经干细胞模型、构建方法及应用。

技术介绍

[0002]帕金森(Parkinson disease,PD)是一种中老年常见的神经系统退行性疾病，其主要临床表现为静止性震颤、步态不稳、运动迟缓等运动障碍，以及非运动症状如神经异常、嗅觉衰退、睡眠障碍疾病。
[0003]PD的典型病理特征是中枢神经系统中以异常a
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突触核蛋白(a
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synuclein,a
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syn)不溶性聚集体为主要成分的路易小体(Lewy body,LB)的形成，导致多巴胺(dopamine,DA)能神经元的进行性死亡和丢失。编码a
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syn的SNCA基因(PARKl/PARK4)，已被证实与PD的发病和相关功能障碍密切相关。SNCA基因编码区及非编码区不同类型的变异均会引起转录及翻译水平的上调，继而导致a
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syn的过表达和不溶性聚集体的形成及播散，因此，下调SNCA基因的表达水平、减少a
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syn聚集体的形成和播散、促进a
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syn聚集体的降解等途径能够有效缓解因SNCA基因变异引起的PD病变。
[0004]LRRK2是属于tyrosine kinase
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like(TKL)亚族的激酶，TKL亚族中的激酶与许多细胞功能密切相关。LRRK2突变携带者约占整个家族性PD患者的7％，此外，在其携带者中还发现了一系列其它症状如痴呆和肌萎缩等6，表明LRRK2突变不仅会引起PD。LRRK2在脑内和其他器官如肾脏中都有表达，其C端独特的5个保守结构域有着包括与底物结合、蛋白质磷酸化及蛋白质一蛋白质相互作用在内的多重功能，LRRK2蛋白共2527个氨基酸，在C端含有5个保守的结构域，分别是leucine
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rich
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repeat(LRR)、Roc GTPase(ROC)、C terminal of ROC(COR)、kinase和WD40结构域。
[0005]通过构建在体外构建PD疾病相关基因的模型细胞，往往成为对PD疾病作用的相关药物筛选的必备技术储备之一。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于至少提供一种能够同时稳定过表达SNCA基因和LRR基因的模型细胞，以为PD相关药物筛选提供技术储备和帮助。
[0007]第一方面，本专利技术实施例公开了一种重组pGC
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FU慢病毒的构建方法，所述重组慢病毒可独立地表达SNCA基因和LRR基因，SNCA基因如SEQ ID NO.5所示，LRR基因如SEQ ID NO.6所示，所述构建方法包括以下步骤：
[0008]分别构建SNCA的重组质粒和LRR序列的重组质粒；
[0009]以SNCA的重组质粒为模板，以第一引物对扩增得到第一片段，所述第一片段包含SNCA的序列片段和中间片段；所述中间片段的序列如SEQ ID NO.7所示；
[0010]以LRR的重组质粒为模板，以第二引物对扩增得到第二片段，所述第二片段包含LRR的序列片段和所述中间片段；
[0011]以包含第一片段和第二片段的混合物作为模板，以第三引物对得到共表达片段；
[0012]以pGC
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FU慢病毒载体为基础，将所述共表达片段连接至pGC
‑
FU慢病毒上，以得到重组pGC
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FU慢病毒。
[0013]在本专利技术实施例中，所述第一引物对包含F1:如SEQ ID NO.8所示和R1：如SEQ ID NO.9所示；所述第二引物对包含F2:如SEQ ID NO.10所示和R2：如SEQ IDNO.11所示；所述第三引物对包含F1和R2。
[0014]在本专利技术实施例中，所述第一引物对包含F4:如SEQ ID NO.14所示和R4：如SEQ ID NO.15所示；所述第二引物对包含F3:如SEQ ID NO.12所示和R3:如SEQ IDNO.13所示；所述第三引物对包含F3和R4。
[0015]在本专利技术实施例中，得到所述第一片段和得到所述第二片段的PCR扩增体系均包括：1μL模板DNA、2μL 10
×
Buffer、2μL dNTP Mixture(10mM)、2μL MgSO4(25mM)、0.6μL 10μM上游引物、0.6μL 10μM下游以为你、0.5μL 1U/μL KOD、双蒸水补齐至20μL体系；得到所述第一片段和得到所述第二片段的PCR扩增的PCR反应程序为：94℃预变性5min，98℃变性30s，56℃退火30s，68℃延伸2min、32个循环，68℃延伸5min。
[0016]在本专利技术实施例中，以pGC
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FU慢病毒载体为基础，将所述共表达片段连接至pGC
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FU慢病毒的步骤具体包括：
[0017]获得线性化的pGC
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FU片段；
[0018]利用In
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Fusion交换酶将所述共表达片段与所述线性化的pGC
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FU片段于25℃反应30min后、再于42℃反应15min完成连接。
[0019]在本专利技术实施例中，连接反应的反应体系为In
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Fusion交换酶0.5μL、10
×
In
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Fusion交换酶缓冲液2μL、线性化的pGC
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FU片段2μL、所述共表达片段2μL和双蒸水13.5μL。
[0020]第二方面，本专利技术实施例公开了一种重组pGC
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FU慢病毒，所述重组慢病毒可独立地表达SNCA基因和LRR基因，SNCA基因如SEQ ID NO.1所示，LRR基因如SEQ ID NO.2所示，所述重组pGC
‑
FU慢病毒经由第一方面所述的构建方法制备得到。
[0021]第三方面，本专利技术实施例公开了一种猪神经干细胞模型的制备方法，包括将第一方面所述的构建方法得到的重组pGC
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FU慢病毒转染至猪神经干细胞的步骤；所述猪神经干细胞模型于MTT试验检测方法中具有相对于猪神经干细胞的细胞活性增强和线粒体数量增多，所述猪神经干细胞模型具有于细胞核的SNCA和LRR的表达增强。
[0022]第四方面，本专利技术实施例公开了第一方面所述的构建方法得到的重组pGC
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FU慢病毒、或第二方面所述的重组pGC
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FU慢病毒、或第三方面所述猪神经干细胞模型在帕金森疾病药物筛选或帕金森细胞模型中的应用。
[0023]与现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果之一：
[0024]本专利技术实施例分别构建了与帕金森病变相关基因SNCA和LRR的质粒载体，并以此为基础攻击能够SNCA和LRR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组pGC
‑
FU慢病毒的构建方法，其特征在于，所述重组慢病毒可独立地表达SNCA基因和LRR基因，SNCA基因如SEQ ID NO.5所示，LRR基因如SEQ ID NO.6所示，所述构建方法包括以下步骤：分别构建SNCA的重组质粒和LRR序列的重组质粒；以SNCA的重组质粒为模板，以第一引物对扩增得到第一片段，所述第一片段包含SNCA的序列片段和中间片段；所述中间片段的序列如SEQ ID NO.7所示；以LRR的重组质粒为模板，以第二引物对扩增得到第二片段，所述第二片段包含LRR的序列片段和所述中间片段；以包含第一片段和第二片段的混合物作为模板，以第三引物对得到共表达片段；以pGC
‑
FU慢病毒载体为基础，将所述共表达片段连接至pGC
‑
FU慢病毒上，以得到重组pGC
‑
FU慢病毒。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一引物对包含F1:如SEQ ID NO.8所示和R1：如SEQ ID NO.9所示；所述第二引物对包含F2:如SEQ ID NO.10所示和R2：如SEQ ID NO.11所示；所述第三引物对包含F1和R2。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第一引物对包含F4:如SEQ ID NO.14所示和R4：如SEQ ID NO.15所示；所述第二引物对包含F3:如SEQ ID NO.12所示和R3:如SEQ ID NO.13所示；所述第三引物对包含F3和R4。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，得到所述第一片段和得到所述第二片段的PCR扩增体系均包括：1μL模板DNA、2μL10
×
Buffer、2μL dNTP Mixture(10mM)、2μL MgSO4(25mM)、0.6μL 10μM上游引物、0.6μL 10μM下游以为你、0.5μL 1U/μL KOD、双蒸水补齐至20μL体系；得到所述第一片段和得到所述第二片段的PCR扩增的PCR反应程序为：94℃预变性5...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵策，王晓娟，
申请(专利权)人：浙江双糖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：