【技术实现步骤摘要】
本申请涉及骨髓间充质干细胞，尤其涉及骨髓间充质干细胞的外泌体、体外培养方法以及应用。
技术介绍
1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)主要的生物学特性包括高度的自我更新、多向分化及独特的免疫调节能力，其免疫调节能力则主要是通过mscs与先天免疫和适应性免疫系统的细胞相互作用，分泌细胞调节性因子发挥免疫调节功能。来源于间充质干细胞外泌体(exosomes from mesenchymal stem cells，mscs-exo)在组织的修复、免疫调节及疾病的治疗过程中发挥着至关重要的作用，可能为临床疾病诊断和治疗提供新的策略。
2、mscs-exo不仅表达所有外泌体共同表达的蛋白标志物，还表达mscs细胞膜表面的一些黏性分子(如：cd90、cd105、cd29、
3、cd44、cd73)。同时，也存在一些其他种类的蛋白如alix、tsg101、肌动蛋白、微管蛋白、膜联蛋白(ⅰ、ⅱ、ⅴ和ⅵ)及一些信号转导蛋白和组织相融性抗原。另外，mscs-exo富含胆固醇和鞘磷脂，具有脂质双分子层结构，从mscs-exo中分离得到的脂肪酸主要有花生四烯酸、二十二碳六烯酸、白三烯、磷脂酸和前列腺素溶血磷脂酰胆碱。除此之外，mscs-exo内还含有大量的rna(microrna和mrna)，少量线粒体dna(mtdna)、长链非编码rna(lncrna)、核糖体rna(rrna)、pirna、trna、snorna和snrna。
4、由于外泌体中功能蛋白往往由被其分泌的细胞所决定
技术实现思路
1、有鉴于此，本申请的目的在开拓新型的外泌体，以促使其具有促进细胞增殖、再生和分化的作用，以适应更多应用领域。
2、第一方面，本申请实施例公开了一种骨髓间充质干细胞的外泌体，以elisa方法检测结果计，所述外泌体包含colii、cxcl9、vegf-a、ets1、pdzk1、kdr、p-kdr、cx26、cx30、cx31和cx31.1蛋白，所述外泌体不包含colii、cxcl9、vegf-a、ets1和pdzk1相关核酸物质。
3、在本申请实施例中，所述外泌体的平均粒径为82.9～111.0nm，pdi值为0.162～0.210。
4、第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的外泌体的体外培养方法，包括以下步骤：
5、获得骨髓间充质干细胞的工作种子细胞；
6、第一次传代培养以得到第一代细胞培养物，所述第一代细胞培养物是将所述工作种子细胞接种于第一条件培养基培养得到的，所述第一传代培养基为包含1-(5-哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(h-7)的dmem/f12培养液；
7、第二次传代培养以得到第二代细胞培养物，所述第二代细胞培养物是将所述第第一代细胞接种于第二条件培养基培养得到的，所述第二传代培养基为包含4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、6-(环辛基氨基)喹啉-5,8-二酮和转化生长因子-β的dmem/f12培养液；
8、第三次传代培养以得到第三代细胞培养物，所述第三代细胞培养物是将所述第二代细胞接种于第三条件培养基培养得到的，所述第三代培养物中包含所述外泌体，所述第三条件培养基为包含4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、转化生长因子-β和肝细胞生物因子的dmem/f12培养液；以及
9、分离纯化所述第三代细胞培养物，以得到所述外泌体。
10、在本申请实施例中，在进行所述第三次传代培养后，所述体外培养方法还包括以下步骤：将所述第三细胞培养物接种至平铺有温敏凝胶的所述第三培养液中培养，以得到分泌所述外泌体的培养物。
11、在本申请实施例中，所述第一条件培养基为包含3～15μm 1-(5-哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(h-7)、0.5～2μm地塞米松、10～60μg/ml抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸钠以及10％v/v fbs的dmem/f12培养液。
12、在本申请实施例中，所述第二条件培养基为包含10～20μm 4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、1～5μm 6-(环辛基氨基)喹啉-5,8-二酮、5～10ng/ml转化生长因子-β以及10％v/v fbs的dmem/f12培养液。
13、在本申请实施例中，所述第三条件培养基为包含1～5μm 4-甲基-5-{[(2s)-2-甲基-1,4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、20～50ng/ml转化生长因子-β、100～200ng/ml肝细胞生物因子、100～200ng/ml低氧诱导因子1α以及10％v/v fbs的dmem/f12培养液。
14、在本申请实施例中，所述第三次传代培养的培养条件为35℃、饱和湿度、5％co2和2％o2，培养时间为48h。
15、在本申请实施例中，分离纯化所述第三代细胞培养物以得到所述外泌体的步骤具体包括：
16、所述第三代细胞培养物，用于无菌pbs洗涤后，经300×g、10min；2000×g、10min和10000×g、30min的离心程序进行差速离心后，再次100000×g离心70min，得沉淀用pbs重悬，即为外泌体。
17、第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的外泌体、或者第二方面所述的体外培养方法制得的外泌体在制备医用填充物、创面修复药物或保健品中的应用。
18、与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
19、本申请通过对小鼠骨髓间充质干细胞进行三次传代培养以及三维凝胶培养，使得其大量分泌外泌体，由此制得的外泌体包含colii、cxcl9、vegf-a、ets1、pdzk1、kdr、p-kdr、cx26、cx30、cx31和cx31.1蛋白，所述外泌体不包含colii、cxcl9、vegf-a、ets1和pdzk1相关核酸物质。本申请进一步通过细胞试验证实了外泌体中的这些细胞因子、促成骨分化以及血管形成的功能蛋白，具有促使成纤维细胞培养物软骨分化和血管形成的作用，提示该外泌体具有应用于医学填充、创面修复等领域的应用前景。最后，本申请实施例还通过动物实验证实了盖外泌体对小鼠创面的修复功能。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种骨髓间充质干细胞外泌体的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，在进行所述第三次传代培养后，所述体外培养方法还包括以下步骤：
3.权利要求1或2所述的培养方法培养得到的骨髓间充质干细胞外泌体。
4.权利要求3所述的外泌体在制备医用填充物上的应用。
5.权利要求3所述的外泌体在创面修复药物上的应用。
6.权利要求3所述的外泌体在保健品上的应用。
【技术特征摘要】
1.一种骨髓间充质干细胞外泌体的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，在进行所述第三次传代培养后，所述体外培养方法还包括以下步骤：
3.权利要求1或2所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓娟，
申请(专利权)人：浙江双糖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。