【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提升酿酒酵母血红素供给水平的方法及其应用，属于基因工程。
技术介绍
1、血红素是一种由亚铁离子(fe2+)和原卟啉i组成的卟啉衍生物，是血红蛋白、肌红蛋白以及细胞色素c的重要辅基，在运输氧、消除活性氧和电子转移方面发挥着重要作用。目前，血红素被广泛用作供铁剂，用于医疗保健和膳食补充剂。然而，获取血红素主要有两大途径：第一，从畜禽血中提取，血红素化学合成基本都是使用有机萃取或酶水解从生物样品(例如植物组织和动物血液)中分离游离血红素，但是这种方法由于需要使用多种有害化学试剂且提取工艺复杂，并不适合大规模工业化生产。第二，利用微生物细胞工厂异源合成血红素，由于生物合成法具有低成本、条件温和、环境友好等优点，因此成为血红素合成的首选方法。
2、随着干细胞培养的快速发展，在实验室生产少量的人造肉已经成为可能。由于成本高，人造肉仍处于发展初期。另外，目前的人造肉不能很好地模拟肉的真实的颜色和质地。因此，满足肌肉组织的真实颜色和营养风味的这些特征主要由血红素蛋白、肌红蛋白提供，血红素作为血红蛋白和肌红蛋白的必要组成部分越来越受到广泛关注。在常见的微生物底盘中，酿酒酵母一种单细胞真核生物，没有内毒素，也没有溶原性病毒，繁殖速度快，能进行高密度培养，在酿酒工业和面包业使用有数千年历史，是一种合适的gras(通常被认为是安全的)宿主，因此，应用的酿酒酵母表达系统来合成血红素是最佳的选择。
3、利用酿酒酵母合成血红素需要解决三个方面的难题：第一，血红素合成途径存在的空间隔离。在酿酒酵母中，由hem1p催化合
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种提升血红素供给水平的基因工程菌，是在出发菌株的基础上，进行了如下至少一种改进：
2、(1)多拷贝表达核苷酸序列如gene id:851818所示的hem1基因；
3、(2)表达核苷酸序列如gene id:851614所示的hem13基因、截短的hem14基因hem14p40-539和截短的hem15基因hem15p30-393,使截短的hem14p40-539和截短的hem15p30-393定位于线粒体。
4、在一种实施方式中，截短的hem1p53-549具有如seq id no.7所示的核苷酸序列；截短的hem14p40-539具有如seq id no.8所示的核苷酸序列；截短的hem15p30-393具有如seq idno.9所示的核苷酸序列。
5、在一种实施方式中，所述多拷贝表达是使hem1基因的拷贝数≥2。
6、在一种实施方式中，所述hem1基因通过质粒py26表达。
7、在一种实施方式中，所述hem1基因以质粒py26为表达载体，以tef启动子调控表达。
8、在一种实施方式中，所述hem1基因整合在所述菌株的基因组dna上。
9、在一种实施方式中，所述hem1基因整合在多克隆位点δ位点处。
10、在一种实施方式中，所述出发菌株还将cbd自组装结构域的编码基因整合在cut416d所在位置。
11、在一种实施方式中，所述cbd自组装结构域的编码基因如seq id no.6所示。
12、在一种实施方式中，所述hem13基因、截短的hem14(hem14p40-539)和截短的hem15(hem15p30-393)基因由启动子tef1起始转录。
13、在一种实施方式中，所述基因工程菌包括但不限于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或葡萄汁酵母(saccharomyces uvarum)。
14、在一种实施方式中，所述基因工程菌还表达大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白或牛血红蛋白中的一种或多种。
15、在一种实施方式中，所述大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白或牛血红蛋白以质粒pesc为表达载体。
16、截短的hem1p53-549，截短的hem14p40-539和截短的hem15p30-393在实现基因定位于线粒体中的应用。
17、本专利技术还提供所述基因工程菌在发酵生产血红素、血红蛋白和/或肌红蛋白中的应用。
18、在一种实施方式中，所述应用是将所述基因工程菌在发酵培养基中，于25～35℃发酵至少24h。
19、在一种实施方式中，所述发酵培养基中为包括但不限于添加亚铁离子的ynb、ypd培养基。
20、在一种实施方式中，所述发酵培养基含有菌体所需必须的氨基酸。
21、在一种实施方式中，所述血红蛋白包括具有功能活性的大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪血红蛋白或牛血红蛋白。
22、有益效果：
23、(1)本专利技术通过截短的hem1p53-549，截短的hem14p40-539和截短的hem15p30-393实现了三个蛋白定位于线粒体，解除血红素合成过程中的空间隔离障碍；
24、(2)通过在酿酒酵母基因组的cut416d位点整合含有seq id no.6所示的核苷酸序列自组装的结构域cbd，实现关键酶胞内自组装，提高血红素合成，实现胞内血红素达到0.3mg/l；
25、(3)本专利技术通过表达具有功能活性的大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白和牛血红蛋白，为在酿酒酵母中合成以血红素为辅基的蛋白提供胞内供给奠定基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种提升血红素供给水平的基因工程菌，其特征在于，在出发菌株的基础上，进行了如下至少一种改进：
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述Hem14p40-539具有如SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列；所述Hem15p30-393具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述多拷贝表达是使HEM1基因的拷贝数大于等于2。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述HEM1基因以质粒pY26为表达载体，以TEF启动子调控表达。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述HEM1基因整合在多克隆位点δ位点处。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株还将CBD自组装结构域的编码基因整合在cut416d所在位置。
7.根据权利要求1或6所述的基因工程菌，其特征在于，所述HEM13基因、Hem14p40-539和Hem15p30-393基因由启动子TEF1起始转录。
8.根据权利要求1～7任一所述
9.根据权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还表达大豆血红蛋白、三叶草血红蛋白、猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、猪血红蛋白或牛血红蛋白中的一种或多种。
10.权利要求1～9任一所述的基因工程菌在发酵生产血红素、血红蛋白和/或肌红蛋白中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种提升血红素供给水平的基因工程菌，其特征在于，在出发菌株的基础上，进行了如下至少一种改进：
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述hem14p40-539具有如seq idno.8所示的核苷酸序列；所述hem15p30-393具有如seq id no.9所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述多拷贝表达是使hem1基因的拷贝数大于等于2。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述hem1基因以质粒py26为表达载体，以tef启动子调控表达。
5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述hem1基因整合在多克隆位点δ位点处。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵鑫锐，薛技科，周景文，王淼，堵国成，陈坚，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。