一种长保质期的高活性间充质干细胞提取液及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种长保质期的高活性间充质干细胞提取液，间充质干细胞因子提取液中含有基于其质量0.05％～0.5％牛跟腱缺端胶原蛋白、1％～4％的海藻糖和1.25％～3.5％的透明质酸。本申请提供的高活性间充质干细胞提取液，含有高浓度细胞因子，具有显著的抗衰老效果，并且在保证细胞因子有效浓度的同时不添加任何化学防腐剂仍能达到较长的保存时间，特别适用于制备修复表皮细胞抗衰老的生物制品或化妆品。化妆品。化妆品。

【技术实现步骤摘要】
一种长保质期的高活性间充质干细胞提取液及其制备方法


[0001]本申请涉及生物
，具体涉及一种长保质期的高活性间充质干细胞提取液及其制备方法。

技术介绍

[0002]随着社会和现代科学的发展、人们物质生活水平的极大丰富，人们对美和年轻化的追求也越来越高。如何有效改善皮肤，使肌肤保持相对年轻化的状态，是美容和化妆品行业一直不懈追求的目标。目前大多数市售化妆品只是对皮肤表面营养的补给或对衰老皮肤的遮盖，而不能真正有效渗透至细胞真皮层，无法深层次的改善肌肤的老化暗沉等状况，更无法抑制皮肤细胞的衰老和促进新生细胞的产生。
[0003]间充质干细胞(MSCs)是来源于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种细胞的能力。MSCs可从骨髓、脂肪、脐带中分离并制备获得。研究表明脐带来源的MSCs与其他来源的MSCs相比具有来源丰富、采集方便、增殖分化能力强、免疫原性低、无伦理问题等诸多优点，在干细胞研究及应用领域扮演了极其重要的角色。近年的研究报道表明MSCs对组织器官的修复功能除了依靠其自我复制和定向分化的能力之外，更多是依赖其分泌的大量细胞因子来调节机体内微环境，激活患者体内休眠的干细胞，从而达到改善机体病理及生理状况的效果。体外培养的间充质干细胞也能释放大量细胞因子，如肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β1(TGFr/>‑
β1)、胰岛素样生长因子(IGF)、组织基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP
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1)等，这些因子已被证明具有清除自由基、抗氧化、创伤修复、增强皮肤的抗敏能力、延缓皮肤衰老、合成胶原蛋白、维持足够的胶原纤维和弹性纤维等作用，因此干细胞活性因子在医学美容领域的应用将颠覆传统意义的化妆品行业。
[0004]由于活性因子容易失活，因此活性因子含量越高，产品的保存有效期越短。此前有人通过添加防腐剂延长活性因子有效期，但防腐剂的添加对人体存在一定的危害，也容易影响活性因子本身的抗老效果。所以，现有大多数方法得到的间充质干细胞上清液或其相关抗老产品中普遍存在生长因子量少、保存有效期短、含有动物源成分易致敏、含有防腐剂等问题。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本申请旨在提供一种生长因子含量高、保存有效期长、皮肤渗透性好、不含动物源成分，并且不含防腐剂的高活性间充质干细胞提取液。
[0006]一方面，本申请提供了一种长保质期的高活性间充质干细胞提取液，所述间充质干细胞因子提取液中含有基于其质量0.05％～0.5％牛跟腱缺端胶原蛋白、1％～4％的海藻糖和1.25％～3.5％的透明质酸。
[0007]本申请提供的高活性间充质干细胞提取液，除间充质细胞因子提取液具有显著的
抗衰老修复作用外，添加牛跟腱来源缺端胶原蛋白(经酶切去掉致敏端)，能够加快皮肤细胞的新陈代谢速度，促进角质的自然脱落，消除色素沉淀，调整肌肤的内分泌功能，保持肌肤的水油平衡，清除体内自由基，修复断裂、老化的弹力纤维，使皮肤弹性恢复等作用。而上述组合物中加入的海藻糖，易于被皮肤吸收，进入细胞内发挥其独特的水替代应激因子作用和保护细胞膜的功能，提高细胞的抗干燥、抗冷冻能力，是皮肤细胞DNA的保护修复因子，并且还能够有效保护干细胞因子活性及蛋白的稳定性，提高保存时间，也有效避免了防腐剂的使用。同时，加入的透明质酸能够增加化妆品的渗透性及保湿效果，有效锁住营养和水分。
[0008]进一步的，所述透明质酸包括0.05％～0.5％分子量为小于等于5000Da超活透明质酸，0.1％～0.5％分子量为小于等于1万Da的寡聚透明质酸、0.1％～0.5％分子量为1万～100万Da的超小分子透明质酸、0.5％～1％分子量为100万～180万Da的小分子透明质酸和0.5％～1％分子量为180万～300万Da的大分子透明质酸。
[0009]其中，不同浓度和不同分子量的透明质酸对皮肤有着不同的保护作用，寡聚透明质酸能够透皮吸收至真皮层，深层锁水；超小分子透明质酸HA
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TLM能够软化角质层，柔嫩肌肤；小分子透明质酸HA
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T和大分子透明质酸HA
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THM能够有效锁住肌肤的营养和水分，对抗UV/雾霾，长效保湿。并且不同分子量透明质酸复配对上清液活性蛋白因子也起到一定的保护作用，能够有效延长化妆品的保存时间。
[0010]另一方面，本申请还提供了上述的间充质干细胞提取液在制备抗衰老和修复表皮细胞的生物制品和/或化妆品中的应用。
[0011]另一方面，本申请还提供了上述的间充质干细胞提取液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
[0012]步骤一：将脐带组织块铺设在培养瓶底部，倒置烘烤，待组织块贴壁后，将培养瓶正置并添加培养基，培养7～10天获得原代细胞；
[0013]步骤二：对所述原代细胞进行消化、重铺、传代，原代细胞重铺后获得的细胞记为P1代，并传代至P7代，并收集P3至P7代的培养上清液混合，作为所述间充质干细胞因子提取液；
[0014]步骤三、按质量百分比向间充质干细胞提取液中加入牛跟腱缺端胶原蛋白、透明质酸和海藻糖，于无菌环境下在搅拌、混匀、密封，并于4℃～8℃下保存。
[0015]其中，将细胞传代的代数控制在3～7代以内，细胞融合度控制在75％～85％左右，能够使得细胞生长处于旺盛期且干细胞干性强，纯度高。
[0016]进一步的，所述步骤一中，烘烤处理温度为37℃～40℃，处理时间为2～8h；优选的，处理温度为37℃，处理时间为2h
[0017]本申请通过在对脐带组织块进行原代培养时，先进行烘烤处理，再加入培养液，如此可使得组织块贴壁更牢固，不易受流体培养基的流动影响，间充质干细胞更容易从组织块中快速爬出贴到瓶壁上，而且贴壁处理使得红细胞等杂细胞有效减少，间充质细胞生长更加旺盛，生长状态较好，细胞因子分泌水平高，纯度高。
[0018]进一步的，所述步骤二中，将收集的间充质干细胞的上清液混合，于3℃～5℃、2000～3000rpm下离心8～12min，用0.22μm的滤网过滤获得滤液；优选的，于4℃、2500rpm下离心10min。
[0019]其中，0.22μm筛网过滤可进一步去除细胞碎片，而保留活性因子，使得化妆品外观清澈明朗，从视觉上满足使用者需求。
[0020]进一步的，所述步骤二中，收集每代细胞生长至融合度75％～85％时的上清液。
[0021]进一步的，所述间充质干细胞因子提取液的制备方法中细胞培养条件为二氧化碳体积浓度5％、氧气体积浓度0.5％。
[0022]在一种优选的实施方式中，充氮气(0.5mPa，3分钟，每4h充一次)制造二氧化碳体积浓度5％、氧气体积浓度0.5％的低氧环境。在该低氧环境下培养的间充质细胞可明显上调人类生长因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种长保质期的高活性间充质干细胞提取液，其特征在于，所述间充质干细胞因子提取液中含有基于其质量0.05％～0.5％牛跟腱缺端胶原蛋白、1％～4％的海藻糖和1.25％～3.5％的透明质酸。2.根据权利要求1所述的长保质期的高活性间充质干细胞提取液，其特征在于，所述透明质酸包括0.05％～0.5％分子量为小于等于5000Da超活透明质酸，0.1％～0.5％分子量为小于等于1万Da的寡聚透明质酸、0.1％～0.5％分子量为1万～100万Da的超小分子透明质酸、0.5％～1％分子量为100万～180万Da的小分子透明质酸和0.5％～1％分子量为180万～300万Da的大分子透明质酸。3.如权利要求1或2所述的间充质干细胞提取液在制备抗衰老和修复表皮细胞的生物制品和/或化妆品中的应用。4.如权利要求1或2所述的间充质干细胞提取液的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一：将脐带组织块铺设在培养瓶底部，倒置烘烤，待组织块贴壁后，将培养瓶正置并添加培养基，培养7～10天获得原代细胞；步骤二：对所述原代细胞进行消化、重铺、传代，原代细胞重铺后获得的细胞记为P1代，并传代至P7代，并收集P3至P7代...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立媛，郭伟，罗昀，宋珂慧，
申请(专利权)人：济南赛尔生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：