本发明专利技术提供了一种融合蛋白及其核苷酸序列，包括弓形虫亲环素蛋白亚单位和T细胞抗原表位。以及一种使用该融合蛋白的用于犬预防弓形虫病的疫苗及其疫苗组合物。本发明专利技术的有益效果在于，所述融合蛋白具有高表达量、高免疫原性的特点。所述疫苗及疫苗组合物，可有效预防犬弓形虫病并且疫苗稳定性高。犬弓形虫病并且疫苗稳定性高。犬弓形虫病并且疫苗稳定性高。
【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及一种犬弓形虫亚单位疫苗及其疫苗组合物
[0001]本专利技术涉及免疫学和生物学领域，具体的说，本专利技术涉及一种犬弓形虫基因工程亚单位疫苗和制备方法及其应用，主要涉及一种用于犬弓形虫疫苗的核苷酸序列、融合蛋白、疫苗和制备方法及其应用。
技术介绍
[0002]犬弓形虫又名刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，T.gondii)，属于原生动物界、顶覆门、孢子虫纲、真球虫目、肉孢子虫科、弓形虫属的单细胞寄生虫，几乎能够侵染所有温血动物的有核细胞，是严格的专性细胞内寄生虫，只有入侵至细胞内的虫体才能进行增殖。弓形虫的发现已有100多年的历史，早在1900年，学者Laveran从麻雀体内发现了疑似弓形虫的寄生虫，但当时并未对其命名弓形虫；1908年，Nicolle和Manceaux报道了从北非刚地梳趾鼠肝脏和脾脏中发现呈月牙形的寄生虫，由此命名为刚地弓形虫。1937年，弓形虫首次在人体中被发现；直至1941年，在一例急性脑炎患者体内分离出一株弓形虫，被并名为弓形虫RH株；1964年，我国发现首例弓形虫病。人和动物感染弓形虫的来源主要是卵囊污染的食物、未被煮熟的含有包囊的肉制品及器官移植等。近年来，在海洋哺乳动物体内发现有弓形虫感染。根据弓形虫的毒力强弱，目前弓形虫被分为三个主要的基因型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型；Ⅰ型为强毒株，RH株为其代表虫株；Ⅱ型和Ⅲ型为弱毒株。弓形虫病是由弓形虫引起的一种全世界范围的人兽共患食源性寄生虫病。弓形虫作为一种机会性致病的原虫，在正常情况下，80％～90％的人感染无临床表现或有轻微的流感症状；但当机体在免疫缺陷的情况下(如艾滋病人、器官移植病人或放射治疗的病人)，将会出现为严重的临床症状，甚至引发死亡；另外，孕妇在怀孕期间初次感染弓形虫将会引起胎儿流产、死胎或畸形等。弓形虫在全世界范围内均有分布，全球约有1/3的人口受弓形虫的威胁，但不同国家、地区的感染率差异较大，例如欧洲和南美部分地区的弓形虫感染率高达80％～90％，我国弓形虫的感染率在10％左右。调查发现，癌症患者的感染弓形虫的比率明显高于健康人，尤其肺癌患者感染弓形虫率高达60.94％，其次，宫颈癌患者感染弓形虫率为50％。；而且弓形虫感染可能会导致一些精神性疾病，如精神分裂、自闭症、精神抑郁等。犬作为伴侣动物更是掀起一阵“犬宠物热”，犬作为弓形虫的重要中间宿主，与人接触亲密，成为人类弓形虫病的主要传染源。目前，抗弓形虫的主要药物有磺胺类药物(如磺胺嘧啶和乙胺嘧啶)和螺旋霉素等，主要用于抑制滋养体时期虫体，而且毒副作用较大。总之，弓形虫病严重威胁着人类的健康。
[0003]迄今为止国内外仍然没有商品化防治弓形虫病的疫苗上市。自上世纪60年代开始，弓形虫疫苗的研制经历了全虫疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和核酸疫苗等几个阶段。全虫疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，全虫灭活疫苗保护率低，因此无实际应用价值；减毒活疫苗存在减毒不充分和毒力返祖等危险，生物安全存在极大的隐患，因此不能广泛使用；亚单位疫苗是从虫体裂解物或排泄-分泌抗原中提取特定组分作为疫苗，具有较好的免疫原性，但纯化费时、费力，并且价格昂贵；核酸疫苗仍旧无法解决免疫原性低的问题，因此普遍研究进展缓慢；基因工程亚单位疫苗是将弓形虫抗原基因在高效表达载体中表达，
从而得到大量纯化的单一抗原，保护率高，生产效率高，生产成本低，且具有极好的生物安全性。综合以上论述可以发现，基因工程疫苗是弓形虫疫苗发展的希望，具有潜在的开发应用价值。
技术实现思路
[0004]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供了一种能用于预防犬感染弓形虫疫病的弓形虫CyP融合蛋白及其疫苗组合物。本专利技术还提供了含有所述弓形虫CyP融合蛋白的药物组合物，如疫苗组合物。此外，本专利技术还提供了编码所述融合蛋白的核苷酸以及制备该融合蛋白的方法等。
[0005]针对目前问题，本专利技术提供一种用于预防犬弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制备方法及其应用。人工合成弓形虫亲环素CyP突变体基因(本专利技术所提供的人工合成弓形虫CyP突变体基因即为本专利技术中所述弓形虫CyP抗原表位突变体的基因)，并将CyP突变体基因转入工程菌进行表达，经诱导后重组抗原获得高效表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的基因工程疫苗，能够预防犬弓形虫疫病的流行。
[0006]1)本专利技术提供了一种新的能用于预防犬弓形虫的疫苗多肽及其疫苗组合物。含有弓形虫保守结构基因CyP的突变体基因Seq ID NO:1(本专利技术提供的弓形虫CyP突变体基因，即弓形虫CyP抗原表位突变体基因)，弓形虫CyP突变体基因后面连接一个T细胞表位(Seq ID NO:3)。本专利技术所提供的用于预防犬弓形虫的蛋白工程疫苗中除了含有主要免疫原性蛋白外，还包含非免疫活性物质。用于本专利技术的非免疫活性物质主要有纯化标签和C端多聚腺苷酸等，包括His亲和层析纯化标签，GEL01佐剂等。本专利技术中，药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐，抗原融合蛋白缓冲液优选的是PBS缓冲液；佐剂为GEL01佐剂；纯化标签及C端多聚核苷酸都是载体上自带的，优选的是pET-28a上所带有的纯化标签及C端多聚核苷酸。
[0007]2)本专利技术提供了一种核苷酸分子，其编码本专利技术1)所述的犬弓形虫基因工程亚单位疫苗蛋白。本专利技术中核苷酸是双链DNA形式，通过人工合成方式合成，经过基因工程操作，将基因片段克隆入载体，制备得到重组载体。将重组载体转化入大肠杆菌中，经筛选、发酵、纯化后获得含有预防犬弓形虫病的融合蛋白。在本专利技术中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接，转化等。核酸设计5
’
端和3
’
端均加入酶切位点，所述的基因操作技术为本领域技术人员所熟知。
[0008]3)本专利技术提供了一种载体，其除了含有本专利技术2)所述的编码犬弓形虫基因工程亚单位疫苗氨基酸的核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达(转录和翻译)所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、核糖体结合位点、增强子、选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，优选的是pet-28a。
[0009]4)本专利技术提供了一种表达菌株，其宿主细胞优选为大肠杆菌，优选的是大肠杆菌BL21(DE3)。所述表达菌株含有本专利技术3)所述的重组载体。宿主细胞经转化含有本专利技术所述编码融合蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的犬弓形虫基因工程亚单位疫苗。
[0010]5)本专利技术提供了一种犬弓形虫基因工程亚单位疫苗的制备方法，其包括以下步
骤：利用本专利技术所构建的基因工程菌株BL21(DE3)-pet-28a-CyP发酵,诱导表达抗原融合蛋白，经过镍离子亲和层析纯化工艺以及后续乳化工艺，获得制备犬弓形虫基因工程亚单位疫苗所需要的抗原融合蛋白。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、离心、澄清、过滤、亲和层析、本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，包括弓形虫亲环素蛋白(CyP)突变体亚单位，其特征在于，所述融合蛋白还包括T细胞抗原表位。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述弓形虫CyP蛋白突变体亚单位为弓形虫CYP抗原表位突变体，所述弓形虫CYP抗原表位突变体的氨基酸序列为Seq ID NO:2所示的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述T细胞抗原表位的氨基酸序列为Seq ID NO:4所示的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述弓形虫CYP抗原表位突变体的编码序列包含Seq ID NO:1所示的核苷酸序列。5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述T细胞抗原表位的编码序列包含Seq ID NO:3所示的T细胞抗原表位的...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯峰，才学鹏，曹利利，刘业兵，陈星远，印春生，赵耘，李思明，宫鹏涛，丁鹤，陈丽萍，王典，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：
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